在日常色譜定量分析中，出現(xiàn)色譜峰形異變或鬼峰，不但嚴(yán)重影響定量精度，甚至使分析工作無法進(jìn)行，本文匯總了各種峰形異變常見類型并加以分析，并給出可能原因，為大家提供一些參考。

 

出現(xiàn)相同類型的拖尾峰

 

色譜圖中所有峰拖尾或峰變形通常是由物理作用導(dǎo)致的，而非化學(xué)作用。

 

如果色譜圖中的峰形均表現(xiàn)相同類型的變形（圖2），主要問題發(fā)生在分析物在色譜柱中遷移之前。

 

圖2. 由于色譜柱篩板部分堵塞或色譜柱塌陷，色譜圖中所有峰形均出現(xiàn)了變形

 

1、原因剖析：

 

1、篩板阻塞：柱子兩頭的過濾篩板如果堵塞，樣品就會(huì)在篩板部分受阻而形成時(shí)間延遲，使得樣品在柱后流出時(shí)峰型形成拖尾。需要通過反沖色譜柱，或者更換篩板。

2、色譜柱塌陷：是指色譜柱由于其它原因引起了柱效率喪失，不能對物質(zhì)形成保留，使得物質(zhì)不在固定相上保留而隨流動(dòng)相流出，但是又還有一點(diǎn)柱效，因此形成拖尾。需要重新填充色譜柱或者更換色譜柱。

柱頭塌陷原因：

A.由流動(dòng)相而不是由樣品引起的，因?yàn)闃悠返倪M(jìn)樣量很小，對填料損傷有限，不至于造成那么大量的硅膠基質(zhì)和鍵合相的流失，而流動(dòng)相的量很大，1.0mL/min的流速，如果pH超標(biāo)或在色譜柱pH耐受范圍臨界點(diǎn)附近長時(shí)間使用，是比較容易造成柱頭塌陷的。

B.硅膠基質(zhì)的溶解規(guī)律是：

a、純水相的流動(dòng)相中硅膠的溶解度遠(yuǎn)大于帶有一定比例有機(jī)相的流動(dòng)相；

b、流動(dòng)相呈堿性比呈酸性更容易溶解硅膠基質(zhì)，pH>9的時(shí)候硅膠溶解顯著；

c、溫度越高硅膠越容易溶解，一般最好控制在40℃以下。

解決辦法：通常無法修復(fù)。

相塌陷：是指常規(guī)C18柱長時(shí)間用高含水量的流動(dòng)相(>90％)長時(shí)間沖洗后，導(dǎo)致保留時(shí)間逐漸變短，最后可能在色譜柱上一點(diǎn)保留也沒有的現(xiàn)象。

 

相塌陷原因：

 

在高含水量的流動(dòng)相條件下，由于C18長鏈不溶于水，長時(shí)間沖洗時(shí)，鍵合上去的C18長鏈慢慢的相互聚集形成單獨(dú)的一相，水也單獨(dú)成一相，因此化合物在流動(dòng)相的帶動(dòng)下越來越難與C18長鏈相互作用實(shí)現(xiàn)保留，最后一點(diǎn)保留都沒有就直接在死體積的位置被沖洗出來。

 

解決辦法：色譜柱出現(xiàn)了相塌陷后，通常用純乙腈或甲醇持續(xù)沖洗可以使出現(xiàn)相塌陷的色譜柱恢復(fù)到原來的狀態(tài)，但完全恢復(fù)需要比較長的時(shí)間，通常30分鐘到1個(gè)小時(shí)是必須的。有一種更好的解決辦法是用丙酮做流動(dòng)相進(jìn)行沖洗，所需時(shí)間更短、效果更好。

 

3、有污染：即樣品不在同一起跑線起跑，從后面開始跑得到達(dá)終點(diǎn)稍晚，表現(xiàn)出拖尾。更換色譜柱或者采用有機(jī)溶劑梯度洗脫1h以上，以沖洗柱子。

4、流動(dòng)相PH值選擇錯(cuò)誤：如某PH下有的樣品存在分子型和離子型的動(dòng)態(tài)平衡，離子型的陸續(xù)向分子型轉(zhuǎn)化就會(huì)表現(xiàn)出拖尾。調(diào)節(jié)PH值可抑制分子解離，改善拖尾，對于堿性化合物，相對較低的PH值更有利于得到對稱峰。

 

詳細(xì)分析：

 

玻璃料或柱頭的空隙部分堵塞，此類峰變形最常見的原因是篩板部分堵塞或色譜柱頭塌陷。

 

除非在推薦的pH范圍之外使用色譜柱，否則現(xiàn)在的柱子基本不會(huì)受到空隙的影響。

 

但是，篩板堵塞仍然是一個(gè)普遍存在的問題。對于5μm的色譜柱，入口端的篩板通常具有2.0μm的孔隙度；對于3μm的色譜柱，具有0.5μm的孔隙度。

 

如果顆粒物來自于樣品，或磨損的泵密封圈或者流動(dòng)相顆粒物進(jìn)入色譜，它們通常會(huì)聚集在篩板上。

 

這些顆粒會(huì)影響樣品在色譜柱入口端的分流，使得部分樣品通過不同的流動(dòng)路徑到達(dá)色譜柱，因此會(huì)晚于另一部分樣品。

由于此時(shí)或此位置未發(fā)生分離，因此所有分析物會(huì)以相同的方式被擾亂，進(jìn)而色譜圖顯示所有峰均具有相似的峰拖尾或變形。

 

2、解決辦法：

 

為了防止這一問題的發(fā)生，如果流動(dòng)相可能含有顆粒（如緩沖沉淀物或灰塵），應(yīng)對其進(jìn)行過濾，并在泵密封嚴(yán)重磨損之前更換新的密封圈。

 

如果樣品含有顆粒碎片，應(yīng)用0.5μm微孔濾膜對樣品進(jìn)行過濾或?qū)悠愤M(jìn)行5min左右的短暫離心，以去除顆粒。

 

強(qiáng)烈建議在自動(dòng)進(jìn)樣器下游安裝0.5μm孔隙度的串聯(lián)過濾器，以過濾任何意外進(jìn)入HPLC系統(tǒng)的顆粒物。如果串聯(lián)過濾器濾片發(fā)生堵塞，系統(tǒng)背壓會(huì)升高；而更換濾片十分簡單、快速和經(jīng)濟(jì)。采用串聯(lián)過濾器可顯著延長色譜柱的使用壽命，而且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。

 

 

 

 

裂峰或雙峰

 

原因：

 

1、樣品或色譜柱污染

 

2、溶劑效應(yīng)

 

3、色譜柱過載

 

3、色譜柱塌陷

 

4、色譜柱兩個(gè)接頭沒有安裝好

 

5、色譜柱性能下降

 

6、柱前篩板部分堵塞

 

如果峰形解析不正確或是未完全分離的重疊峰，可能會(huì)被誤認(rèn)為色譜柱或緩沖液的問題。

 

如果僅部分解析兩個(gè)峰形，則可能會(huì)認(rèn)為其是裂峰或雙峰。如圖3顯示的情形。

 

圖3. 由于存在第二個(gè)組分而產(chǎn)生分裂峰。（a）25ng / mL，和（b）等離子體中10ng/ mL的藥物（第二個(gè)峰）（10 ng/mL血漿中的藥物（第二個(gè)峰））

 

在圖3(a)中，可觀察到與圖2極為類似的峰變形，其表明篩板堵塞。

 

更換色譜柱不能解決此問題，所以篩板堵塞并非導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因。如果減少色譜柱上樣品，如圖3(b)，峰形看起來更像是兩個(gè)峰，而不是一個(gè)肩形峰。

 

由此進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，證實(shí)了存在第二個(gè)峰。調(diào)整方法的條件后，兩個(gè)峰完全分離。

 

 

 

 

伸舌峰

 

1、樣品過載：被保留的樣品在正常出峰時(shí)間前陸續(xù)出來，形成前沿峰。降低樣品含量。

 

2、樣品溶劑選擇不恰當(dāng)：當(dāng)樣品溶劑的洗脫能力大大強(qiáng)于流動(dòng)相時(shí)會(huì)出現(xiàn)前沿峰，例如，在反相色譜中用已腈做樣品溶劑，而流動(dòng)相的洗脫力較弱時(shí)會(huì)出現(xiàn)前沿峰。選擇流動(dòng)相或者接近流動(dòng)相的比例作為樣品溶劑。

 

3、色譜柱損壞：色譜柱柱效損失，不能對物質(zhì)形成保留。更換色譜柱。

 

4、在大峰前有小峰出現(xiàn)，假象前沿峰，即大峰前包埋了沒有分開的小峰。調(diào)整流動(dòng)相洗脫梯度。由于分析方法不適宜導(dǎo)致在主峰前有很多小峰出現(xiàn)，假象前沿峰（非其他因素引起的前沿），大峰包埋了沒有分開的小峰。

 

解決辦法：優(yōu)化分析方法。

 

詳細(xì)解讀：

 

伸舌峰一般是色譜柱內(nèi)發(fā)生溝流或色譜柱結(jié)構(gòu)的坍塌導(dǎo)致的。

 

如果在制造商推薦的條件下使用色譜柱，這種情況則很少發(fā)生。

 

大多數(shù)硅膠柱在pH2-8的范圍內(nèi)可以保持穩(wěn)定。

 

pH低于2時(shí)，鍵合相會(huì)發(fā)生水解；pH高于8時(shí)，硅膠會(huì)溶解。

 

如果您需要在此pH范圍以外使用操作HPLC系統(tǒng)，請確保選擇在選定條件下會(huì)保持穩(wěn)定的色譜柱。

 

圖4顯示了因柱過載（色譜柱發(fā)生溝流）導(dǎo)致的伸舌峰。

 

圖4. 過載導(dǎo)致的伸舌峰。（a）正常的峰形；（b）伸舌峰。

 

圖4a中顯示了正常的峰形；在約500次進(jìn)樣后，觀察到伸舌峰（圖4b）。

 

這種改變是該方法所特有，經(jīng)常在前一次分析結(jié)束后，下一次分析開始時(shí)突然發(fā)生。

 

出現(xiàn)伸舌峰后，唯一有效的解決辦法就是更換色譜柱。

 

該柱內(nèi)徑為100x2.1mm，柱內(nèi)填充5μm 粒徑的C18填料 。流動(dòng)相A是10mM碳酸氫銨（pH9.0） ；B是甲醇（MeOH）。

 

該方法包括5％B等度洗脫段，然后用80%B淋洗。

 

這種特殊的色譜柱可專門用于高達(dá)100％的水流動(dòng)相，且無封端。

 

當(dāng)流動(dòng)相pH值升高時(shí)，封端可保護(hù)硅膠免于溶解。

 

在這種情況下，所使用的色譜柱流動(dòng)相pH應(yīng)遠(yuǎn)高于推薦的范圍，并且無需保護(hù)性封端。硅膠在pH為9時(shí)會(huì)逐漸溶解，直到柱床結(jié)構(gòu)不再穩(wěn)定，并且柱床會(huì)發(fā)生移動(dòng)，產(chǎn)生塌陷或通道，而這又會(huì)導(dǎo)致圖4b伸舌峰的形成。

 

可以使用較低的流動(dòng)相pH或采用在較高pH下能夠保持穩(wěn)定狀態(tài)的色譜柱，以避免這一問題。

 

 

 

寬峰

 

1、色譜柱污染或失效，造成塔板數(shù)降低：更換同樣類型的色譜柱，如果新柱子可以提供對稱的色譜峰，則用強(qiáng)溶劑沖洗舊柱子。

 

2、柱子與檢測器之間的管路太長或管路內(nèi)徑太大：更換內(nèi)徑較小的短管路。

 

3、檢測器對反應(yīng)時(shí)間或池體積響應(yīng)過大：減少響應(yīng)時(shí)間或使用更小的流通池。