CD3雙特異性抗體是治療癌癥的一種有前景的療法。這些分子能夠結(jié)合T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）/CD3蛋白復(fù)合物上的CD3以及腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤相關(guān)抗原（TAA）。當(dāng)CD3和TAA同時被結(jié)合時，T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的接近會導(dǎo)致免疫突觸的形成、T細(xì)胞的激活以及細(xì)胞毒性的產(chǎn)生，造成對腫瘤細(xì)胞的定向殺傷。目前為止已經(jīng)獲批的TCE包括Catumaxomab（2009, CD3/EpCAM，已退市）、Blinatumomab（2014, CD3/CD19）、Tebentafusp（2022, CD3/gp100）、Mosunetuzumab（2022, CD3/CD20）、Teclistamab（2022, CD3/BCMA）、Epcoritamab（2023, CD3/CD20）、Glofitamab（2023, CD3/CD20）、Talquetamab（2023, CD3/GPRC5D）、Elranatamab（2023, CD3/BCMA）、Tarlatamab（2024, CD3/DLL3）、Odronextamab（2024, CD3/CD20）。典型的TCE結(jié)構(gòu)是個三聚合物，由TCE、T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞組成，通過T細(xì)胞激活，釋放炎癥因子和細(xì)胞毒性分子，殺傷腫瘤細(xì)胞。隨著CD3雙特異性抗體的火熱，從2024年下半年開始，國內(nèi)藥企研發(fā)的TCE產(chǎn)品陸續(xù)達成多個海外交易，包括嘉和生物（CD3/CD20）、同潤生物（CD3/CD19）、岸邁生物（CD3/BCMA）、恩沐生物（CD3/CD19/CD20）、維立志博（CD3/CD19/BCMA）、康諾亞（CD3/BCMA）等。再次使得TCE雙抗成為行業(yè)研究的熱點之一，引起了極大的關(guān)注。尤其是TCE在實體瘤的突破，進一步增加了這類產(chǎn)品的應(yīng)用場景和想象空間。

那么對于CD3雙抗TCE這類產(chǎn)品，非臨床安評方面有哪些挑戰(zhàn)呢？早在2018年的時候，F(xiàn)DA CDER與美國健康與環(huán)境科學(xué)研究所（HESI）免疫安全性技術(shù)委員會（ITC）圍繞CD3雙抗TCE產(chǎn)品的臨床前安全性評價相關(guān)主題展開過一系列討論，并以《Summary of a workshop on preclinical and translational safety assessment of CD3 bispecifics》發(fā)表，一起學(xué)習(xí)下各中觀點。

CD3雙抗對T細(xì)胞生物學(xué)作用的影響

來自Regeneron的Jessica Kirshner對這一主題做了分享。正常情況下，T細(xì)胞是通過TCR與主要組織相容性復(fù)合體（pMHC）遞呈的腫瘤肽段的相互作用來識別腫瘤。TCE通過同時結(jié)合T細(xì)胞上的CD3和腫瘤細(xì)胞上的TAA，使T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷不再依賴內(nèi)源性TCR路徑。而且，TCR-MHC/多肽、TCE-TAA兩條路徑誘導(dǎo)的T細(xì)胞生物學(xué)作用非常相似。

這里面還有一個很有意思的話題，“通過CD3傳統(tǒng)的信號強度是否存在最佳情況，比如在不引發(fā)細(xì)胞因子過度釋放和/或T細(xì)胞耗竭的情況下保留抗腫瘤細(xì)胞毒性？如果存在，如何通過實驗確定CD3信號強度的“最佳點”？當(dāng)時，在本次會議上，沒有人表示他們已經(jīng)確定了CD3信號強度的“最佳點”，但正在使用體外T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)來探索這一可能性。不過，2021年，Amgen從Teneobio花費25億美金買了一款保持T細(xì)胞激活的同時，不會刺激細(xì)胞因子過度釋放的靶向PSMA TCE—AMG340。可惜的是，AMG340前列腺癌臨床Ⅰ期的27例患者ORR為0%。2023年，Amgen停止了該產(chǎn)品的進一步開發(fā)。這個想法很好，保留藥效，降低毒性，但其中機制尚未完全研究清楚。

評估CD3介導(dǎo)的T細(xì)胞生物學(xué)作用的指標(biāo)很多，包括CD3下游的信號分子（如活化T細(xì)胞的核因子、NFκB），以及T細(xì)胞激活、增殖、細(xì)胞毒性標(biāo)志物和細(xì)胞因子。還可以在體外實驗中評估TCE與TAA或CD3的不同親和力以及TAA豐度對細(xì)胞的影響。

當(dāng)然，大多數(shù)企業(yè)表示他們主要依賴體內(nèi)試驗數(shù)據(jù)進行項目決策，尤其是安全性相關(guān)的數(shù)據(jù)。除了利用天然野生型，regeneron還使用不同的人源化小鼠模型外，比如表達人類CD3信號復(fù)合體小鼠，以及將人類TAA敲入小鼠基因座，并用于支持藥理學(xué)和安全性相關(guān)的研究。

腫瘤抗原表達及相關(guān)風(fēng)險

與靶點相關(guān)的在靶（on-target）毒性可以分為兩類：一類是“on target/on-tumor”毒性，主要包括細(xì)胞因子釋放及其相關(guān)毒性，嚴(yán)重程度取決于腫瘤負(fù)荷以及TCE到達腫瘤部位的能力。還有一類是“on target/off-tumor”毒性，與TAA在正常組織中的表達水平和分布直接相關(guān)。

由于非臨床安全性測試通常不使用腫瘤疾病模型，因此“on target/on-tumor”相關(guān)的細(xì)胞因子釋放通常不在非臨床階段進行體內(nèi)評估，換句話說，采用健康猴或者其他種屬也實現(xiàn)不了這一毒性的評估。取而代之的是在體外腫瘤細(xì)胞/免疫細(xì)胞共孵育體系中考察細(xì)胞因子產(chǎn)生情況。另外，TAA驅(qū)動的細(xì)胞因子釋放在臨床是可監(jiān)測且可管理的。

與“on target/on-tumor”不同，“on target/off-tumor”毒性的風(fēng)險評估是臨床前研究的重點所在，比如正常組織中靶點分布、細(xì)胞定位和表達水平等。需要在藥理學(xué)相關(guān)動物種屬中開展標(biāo)準(zhǔn)毒理學(xué)研究，特別關(guān)注靶點表達相關(guān)的組織。

安進公司的Hervé Lebrec博士分享了如何評估正常組織中TAA表達和潛在風(fēng)險。首先通過靶點表達的文獻進行全面回顧和總結(jié)，初步了解靶點的表達和分布情況。然而，文獻提供的靶點表達信息往往無法滿足需求，這就需要借助一些試驗手段和工具，比如用于mRNA分析的RNA測序、原位雜交和定量PCR，以及用于蛋白分析的western blot、免疫組化和質(zhì)譜分析。而且，通常需要多種方法交叉確認(rèn)，以全面、客觀了解靶點在不同組織中的表達和分布情況。

同樣來自安進公司的Oliver Thomas對早期靶點風(fēng)險評估在預(yù)測BiTE抗體（安進的雙抗平臺）非臨床安全性特征中的作用進行了回顧性分析。猴通常是TCE非臨床毒理研究中唯一相關(guān)種屬。如果在猴的正常組織中存在目標(biāo)TAA表達，通常在給藥后48小時內(nèi)會觀察到一些反應(yīng)，包括嘔吐、活動減少、食欲不振、腹瀉、短暫體溫升高、急性期反應(yīng)（CRP增加、球蛋白和纖維蛋白原增加、白蛋白減少）、血液學(xué)變化（淋巴細(xì)胞計數(shù)減少、T細(xì)胞激活）、其他白細(xì)胞亞群的變化以及短暫的細(xì)胞因子釋放（如IFN-γ、IL-6、MCP-1和TNF-α）。經(jīng)歷較短的暴露間隔后（約1-4周，取決于分子的活性），可以觀察到更完整、全面的靶器官毒性表現(xiàn)。急性細(xì)胞因子釋放的強度與靶點在正常組織中的表達水平及其特定位置有關(guān)。如果靶點在正常組織中完全不表達，則不會發(fā)生細(xì)胞因子釋放；如果TAA比較容易被CD3雙抗識別（如表達在血細(xì)胞上時），則細(xì)胞因子反應(yīng)通常更強。CD3雙抗觀察到的組織病理學(xué)變化多數(shù)情況下與靶點表達相關(guān)，包括輕微到嚴(yán)重的混合細(xì)胞或淋巴細(xì)胞浸潤、炎癥和/或單細(xì)胞壞死。可以將體內(nèi)毒理研究結(jié)果與靶點表達和分布特點相結(jié)合，進行適當(dāng)?shù)娘L(fēng)險-收益評估，并考慮潛在的毒性可監(jiān)測性和可管理性。

Xencor公司的Liz Bogaert博士認(rèn)為，僅依賴公共數(shù)據(jù)庫中的靶點序列和表達數(shù)據(jù)可能會低估猴中毒理反應(yīng)。以葉酸受體1（FOLR1）這個靶點為例，其在多種正常組織中表達，包括正常肺和腎。猴中的毒性包括細(xì)胞因子釋放，以及肺和腎損傷等，但觀察到的劑量遠(yuǎn)低于預(yù)期。原因是體外活性試驗采用的重組猴FOLR1蛋白序列引用自公開發(fā)表的文獻中的序列，而該序列與猴子中的實際FOLR1序列并不一致。直接導(dǎo)致了CD3雙抗在猴子中的活性和毒性被嚴(yán)重低估。不過，個人認(rèn)為這種情況發(fā)生的概率比較小。

分子結(jié)構(gòu)、CD3和/或TAA親和力對活性、安全性和有效性的影響

輝瑞公司的Adam Root介紹了各種CD3雙抗format，并認(rèn)為企業(yè)在設(shè)計CD3 TCE結(jié)構(gòu)時會考慮多種因素。有些考慮是從實際操作的角度出發(fā)，如知識產(chǎn)權(quán)或生產(chǎn)可行性，另一些考慮則來自科學(xué)驅(qū)動，如T細(xì)胞與靶細(xì)胞之間的空間距離、對CD3和/或腫瘤抗原的結(jié)合價數(shù)（單價、雙價或其他）、給藥方案、特定的PK特性以及預(yù)期的安全性特征。例如，半衰期較短的CD3雙抗在管理新出現(xiàn)的安全性問題方面具有優(yōu)勢，因為可以快速被清除，但在給藥方案方面存在劣勢，需連續(xù)或頻繁給藥。Blinatumomab就是一款結(jié)構(gòu)中沒有Fc的短半衰期TCE，臨床需要長時間連續(xù)靜脈輸注給藥。除了結(jié)構(gòu)外，TCE與CD3的親和力被認(rèn)為是決定療效和安全性的一個關(guān)鍵因素。CD3親和力過高可能會降低系統(tǒng)暴露量，并將CD3雙抗從腫瘤轉(zhuǎn)移到含有T細(xì)胞的組織。親和力過低則可能會降低T細(xì)胞的激活能力，影響藥效。

有人提出CD3結(jié)合的動力學(xué)可能會影響細(xì)胞因子釋放。也有人認(rèn)為CD3結(jié)合表位不同，所引發(fā)的T細(xì)胞作用也有差異。大多數(shù)CD3雙抗靶向CD3ε的N端線性肽，尚不清楚靶向不同的CD3表位是否會導(dǎo)致細(xì)胞毒性與細(xì)胞因子釋放的比率不同。不過，前文已經(jīng)提到，Teneobio開發(fā)出了具備CD3結(jié)合表位差異化的TCE，維持T細(xì)胞毒性的同時，細(xì)胞因子釋放并不明顯，但臨床研究的失利為這一思路蒙上了陰影。

關(guān)于TAA結(jié)合效價問題，與會人員普遍認(rèn)為，根據(jù)結(jié)合親和力和結(jié)構(gòu)，增加結(jié)合效價可能有利于對腫瘤的靶向和重定向，但這些潛在益處會增加CMC研究的復(fù)雜性。放至今日，CMC問題應(yīng)該相對容易解決。

羅氏公司的Anna Maria Giusti博士分享了一個很有意思的案例，兩個分子具有相同腫瘤靶點——FOLR1，相同構(gòu)造（TAA:CD3=2:1），且兩種分子對FOLR1的親和力都高于CD3。不同的是，第一個分子對FOLR1的結(jié)合親和力（affinity）比第二個分子高20倍以上，但由于采用了雙價TAA結(jié)合，兩種分子對腫瘤的結(jié)合親合力（avidity）相似。動物毒理研究結(jié)果顯示，食蟹猴給予低劑量的第一個分子（higher affinity）時，沒有觀察到臨床癥狀，但10 mg/kg劑量的食蟹猴出現(xiàn)了不良反應(yīng)，包括呼吸異常，導(dǎo)致在給藥后24小時實施安樂死，并在肺部觀察到病變（水腫、充血和急性炎癥）。免疫組化顯示，食蟹猴和人肺泡細(xì)胞上表達FOLR1。由于擔(dān)心人體可能會出現(xiàn)類似的肺部病理變化，因此開發(fā)了第二種分子，立項依據(jù)是腫瘤細(xì)胞相對于正常組織表達更高水平FOLR1，第二種分子能保留與腫瘤的類似親合力（avidity）同時，降低對正常組織如肺部的影響。

出乎意料的是，當(dāng)在食蟹猴中測試這種對FOLR1親和力低得多的第二種分子時，觀察到了與第一種分子完全不同的癥狀：眼睛“渾濁”與單核細(xì)胞在睫狀體和虹膜浸潤，前房和后房有滲出物。因此，雖然避免了第一種分子出現(xiàn)的肺部毒性，但觀察到了一種新的毒性表現(xiàn)。通過IHC方法未能在眼睛中找到FOLR1，但通過定量PCR鑒定出了FOLR1 mRNA。因此，兩種對靶標(biāo)具有不同親和力的FOLR1 CD3雙抗顯示出不同的靶點相關(guān)的毒性特征。由于兩種毒性特征均不可接受，因此該項目被終止。這種“on-target/off-tumor”毒性是TCE最不愿看到，也最難避免的毒性，是這類分子開發(fā)失敗的主要風(fēng)險之一。

基因泰克公司的Karen Staflin博士以一個針對HER2的CD3雙抗為例，展示了對CD3和/或TAA的結(jié)合親和力對非臨床療效和耐受性的影響。由于HER2在正常組織中廣泛表達，因此存在對on-target/off-tumor毒性以及細(xì)胞因子釋放的擔(dān)憂。構(gòu)建了基于全長IgG1抗體的HER2/CD3雙抗（1:1形式），并具備低Fc效應(yīng)功能特點。篩選出與CD3靶點親和力差異為30倍，HER2為7倍的不同變體進行組合。最初，將低親和力抗HER2變體與低親和力或高親和力抗CD3配對。兩種分子在體外對HER2陽性靶細(xì)胞表現(xiàn)出強大的細(xì)胞毒性，并在人HER2轉(zhuǎn)基因小鼠模型中觀察到體內(nèi)抗腫瘤藥效。然而，它們的耐受性特征不同。低親和力CD3變體在小鼠和食蟹猴中耐受性良好，但高親和力CD3變體在小鼠中出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放增加和體重減輕，以及食蟹猴出現(xiàn)全身性炎癥反應(yīng)。接下來，將低親和力抗CD3變體與低親和力或高親和力抗HER2配對。在體外細(xì)胞毒性實驗中，使用表達食蟹猴HER2的靶細(xì)胞時，高親和力抗HER2的分子活性表現(xiàn)更好。兩種分子在食蟹猴體內(nèi)均產(chǎn)生了藥理學(xué)反應(yīng)，如淋巴細(xì)胞短暫減少。然而，高親和力抗HER2變體耐受性不如低親和力分子。研究人員通過采用劑量分割方案（第0天給半劑量，第1天給半劑量，第8天給全劑量）減輕了食蟹猴中觀察到的高親和力抗HER2變體的細(xì)胞因子釋放。劑量分割導(dǎo)致在給藥初期雙抗的Cmax降低，同時又維持了總暴露量的不變。在腫瘤異種移植模型中，劑量分割顯示對藥效沒有影響。Karen Staflin博士這個思路其實被用于很多已上市或在研TCE的設(shè)計，即高親和力TAA與低親和力CD3的分子進行配對，臨床則采用step-up dose策略給藥，降低首次給藥Cmax，增加患者耐受性。

來自MacroGenics的Ezio Bonvini博士，也提到了關(guān)于將細(xì)胞毒性與細(xì)胞因子釋放花開兩朵，各表一枝的類似說法，即各論各的。他列舉了一系列CD123/CD3 DART結(jié)構(gòu)的分子，這些分子與CD3結(jié)合表位存在差異。研究比較了CD3的親和力、結(jié)合和解離速率與細(xì)胞毒性EC50的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，一種低親和力的CD3變體在更高濃度下表現(xiàn)出與野生型分子相似的細(xì)胞毒性水平，但在細(xì)胞毒性相當(dāng)?shù)那闆r下，細(xì)胞因子釋放顯著減少。此外，低親和力變體需要更高濃度才能在體外誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，以及在小鼠體內(nèi)模型中需要更高劑量才能實現(xiàn)與野生型分子相似的腫瘤生長抑制效果，但在所有劑量水平下，包括達到最大抗腫瘤效果的劑量，細(xì)胞因子釋放均減少。在食蟹猴中，低親和力CD3變體在高達20 mg/kg的劑量下表現(xiàn)出良好的耐受性，并且暴露量更高、持續(xù)時間更長，而高親和力CD3變體在3 mg/kg劑量下就表現(xiàn)出細(xì)胞因子釋放和較差的耐受性。此外，一種針對B細(xì)胞的低親和力CD3變體（與CD123靶向變體共享相同的CD3結(jié)合臂）在食蟹猴中能夠有效耗竭B細(xì)胞，并表現(xiàn)出良好的耐受性，進一步確認(rèn)了靶向CD123變體的觀察結(jié)果。MacroGenics的CD123/CD3 TCE（MGD024）目前處于臨床Ⅰ期研究階段，并于2022年10與Gilead達成合作，共同開發(fā)。可能有朋友會問，采用同樣思路的Teneobio不是已經(jīng)失敗了嗎，可別忘了，Teneobio開發(fā)的是實體瘤靶點，MacroGenics這個是血液瘤，TCE在血液瘤里面已經(jīng)上市了很多產(chǎn)品，實體瘤卻僅上市了2款產(chǎn)品，失敗了不下幾十個，實體瘤本身就是TCE失敗的重災(zāi)區(qū)。一切還是以臨床數(shù)據(jù)說話，期待MacroGenics通過CD3表位差異的設(shè)計能否在臨床完成低毒、高效的概念驗證。

CytomX的Jennifer Richardson博士分享了TCE中的Probody思路，這是一種抗體前藥設(shè)計，使TCE在腫瘤微環(huán)境中選擇性激活。簡單講，就是TCE的抗原結(jié)合區(qū)域采用遮蔽肽封閉，同時用可被蛋白酶降解的連接子偶聯(lián)。這類蛋白酶在腫瘤中特異性高表達。與未遮蔽的對照分子相比，CytomX的Probody TCE在體外對正常細(xì)胞的抗原結(jié)合和活性降低，同時在某些小鼠異種移植瘤模型中藥效也降低。通過使用更易被蛋白酶切割的底物，克服了小鼠中療效降低的問題。使用較弱的CD3結(jié)合臂和更緊密的遮蔽肽提高了食蟹猴的耐受性。遮蔽肽技術(shù)有可能擴大CD3雙抗的治療窗口。不過，與會者指出，遮蔽肽技術(shù)能否提高治療指數(shù)將取決于其在腫瘤微環(huán)境中選擇性釋放遮蔽肽的能力。需要注意的是，這是發(fā)生在2018年的討論會。那么從2025年，回頭看，CytomX與Amgen合作的CX-904（CD3/EGFR）、與BMS合作的CTLA-4免疫檢查點前藥BMS-986288相繼停止開發(fā)。再次提示，前藥設(shè)計不僅遮蔽那么簡單，有效釋放才是關(guān)鍵。

體內(nèi)藥理學(xué)和毒理學(xué)研究

本部分主要圍繞三個主題進行討論：1）基因工程小鼠在安全性評價中的作用；2）食蟹猴非臨床安全性評價的考量；3）無毒理學(xué)研究相關(guān)動物種屬的考量。

基因工程小鼠在安全性評價中的作用

來自Dartmouth College的Charles Sentman博士展示了CD3雙抗在不同小鼠模型中的療效數(shù)據(jù)，包括在免疫缺陷的NSG小鼠中的胰腺癌模型，以及在免疫正常C57BL/6小鼠中的淋巴瘤（RMA）、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤（B16）數(shù)據(jù)等。發(fā)現(xiàn)，耗竭CD4+或CD8+ T細(xì)胞亞群會影響CD3雙抗藥效。通過基因敲除模型發(fā)現(xiàn)，穿孔素和IFNγ是抗腫瘤作用發(fā)揮的關(guān)鍵成分，但它們也與毒性的產(chǎn)生相關(guān)。經(jīng)過治療后腫瘤完全消退的小鼠，再次接種相同腫瘤后，抗腫瘤作用依然存在，證明CD3雙抗存在免疫記憶。這些可能與TCE在開發(fā)階段的安評相關(guān)性較小，更多提示我們可以基于基因工程改造的小鼠研究TCE藥理學(xué)和毒理學(xué)相關(guān)目的的研究。

Regeneron的 Jessica Kirshner博士重點介紹了通過Velocigene技術(shù)基因工程改造的小鼠，這些小鼠CD3的位置表達人類CD3（胞外區(qū)），并在小鼠細(xì)胞上表達人TAA，即人類CD3和TAA基因的雙敲入。另外，小鼠腫瘤細(xì)胞也同樣導(dǎo)入了人TAA。為了確保模型能夠達到預(yù)期的T細(xì)胞水平以及通過抗人CD3抗體對T細(xì)胞的充分激活，對轉(zhuǎn)基因模型進行了表征。此外，還評估了小鼠組織中人TAA的表達，以確保人TAA表達的一致性。

Kirshner博士分享了REGN1979（CD3/CD20雙抗）和REGN4018（CD3/MUC16雙抗）兩個案例。Regeneron的CD3雙抗是全長抗體，F(xiàn)c通過改造去除了效應(yīng)功能。在REGN1979的案例中，人源化小鼠模型中快速出現(xiàn)了外周血B細(xì)胞耗竭和短暫的細(xì)胞因子釋放，并抑制了腫瘤生長。同樣，REGN1979給予食蟹猴后，發(fā)現(xiàn)了類似的B細(xì)胞耗竭和細(xì)胞因子釋放。此外，對淋巴組織（如脾臟和腸系膜淋巴結(jié)）的免疫組化分析顯示有深度的B細(xì)胞耗竭。在REGN4018的案例中，也使用了CD3和MUC16基因人源化的小鼠模型。小鼠的MUC16在多種具有間皮/漿膜表面的組織中表達（如卵巢、氣管）。REGN4018在小鼠中誘導(dǎo)了抗腫瘤活性，但沒有導(dǎo)致全身性細(xì)胞因子釋放或on target/off tumor組織的病理變化。在食蟹猴中，觀察到稍微不同的反應(yīng)，如CRP和IL-6短暫增加。

總之，基因工程小鼠可以作為初步評估TCE分子藥效和安全性的模型之一。

食蟹猴非臨床安全性評價的考量

Janssen 的Shoba Shetty博士分享了一個案例，展示了通過調(diào)整CD3雙抗的劑量來減輕食蟹猴中的細(xì)胞因子釋放。該分子是一種針對實體瘤靶點的抗體類CD3雙抗，F(xiàn)c去除了效應(yīng)功能。TAA在多種腫瘤類型以及某些正常組織中表達。

在初步的探索性研究中，食蟹猴每周一次或兩次的給藥方案導(dǎo)致了急性細(xì)胞因子釋放相關(guān)的劑量限制性毒性，甚至出現(xiàn)了動物死亡。臨床癥狀表現(xiàn)為嘔吐、弓背和活動減少，主要出現(xiàn)在首次給藥后。觀察到細(xì)胞因子呈劑量依賴性增加，高濃度細(xì)胞因子與死亡相關(guān)，但隨著重復(fù)給藥，細(xì)胞因子水平有所下降。臨床病理學(xué)變化包括白細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）的短暫減少以及急性期反應(yīng)。有趣的是，早期死亡的動物組織中未見鏡檢，而存活動物則表現(xiàn)出多組織的淋巴細(xì)胞浸潤以及表達TAA器官的輕微組織退化/再生。

后續(xù)研究探索了通過低劑量預(yù)處理免疫系統(tǒng)，然后再給予較高劑量，以嘗試減輕細(xì)胞因子介導(dǎo)的毒性。選擇了一個初始的低劑量，預(yù)計動物可以耐受，但會產(chǎn)生藥效學(xué)效應(yīng)（如短暫的淋巴細(xì)胞減少和最小程度的細(xì)胞因子釋放）。評估了兩種動物體內(nèi)劑量遞增方案，測試的最高劑量達到了初始最大耐受劑量的10-25倍。所有動物均存活，臨床癥狀改善，并且細(xì)胞因子（例如IL-6和TNF-α）顯著抑制。

通過step-up給藥方案，可以潛在解決TCE這類產(chǎn)品在食蟹猴毒理學(xué)研究中可能碰到的暴露量不夠的問題。

Genentech的Amy Sharma分享了一個CD3/CLL-1雙抗的案例研究，本品擬用于治療急性髓系白血病（AML）。Genentech評估了兩種CD3雙抗，它們與CD3的親和力相差100倍，與CLL-1的親和力相同。此外，兩株抗體與食蟹猴靶點的親和力均與人體相似。

研究首先在CD3和CLL-1雙靶點人源化小鼠中開展，在0.5 mg/kg的劑量下，兩個分子均能實現(xiàn)單核細(xì)胞的耗竭。不過，同樣劑量在食蟹猴中不能耐受，采用的“哨兵”動物先行給藥的方案。后續(xù)進行了劑量調(diào)整。發(fā)現(xiàn)低親和力分子在較低劑量下，食蟹猴耐受性良好，并在第8天觀察到髓系細(xì)胞最大程度的耗竭。另外，低親和力和高親和力分子的暴露量相似，所有動物均產(chǎn)生了抗藥物抗體（ADA）。低親和力分子誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放低于高親和力分子，但兩者在單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的耗竭程度和持續(xù)時間上相似。兩種分子均表現(xiàn)出雙相反應(yīng)，急性細(xì)胞因子介導(dǎo)的效應(yīng)在給藥后24-48小時出現(xiàn)，而亞急性的on target/off tumor效應(yīng)（如發(fā)熱性中性粒細(xì)胞減少或可能由骨髓抑制引起的繼發(fā)性感染）在給藥后數(shù)天出現(xiàn)。

這個案例給出了3條TCE毒理研究的經(jīng)驗：1）可以設(shè)置哨兵動物，先行給藥，并對哨兵動物設(shè)置7天的觀察期，以考察延遲毒性；2）基于人源化小鼠藥理學(xué)研究設(shè)置食蟹猴試驗的劑量時需謹(jǐn)慎，尤其是小鼠和猴的靶點表達譜可能不一致，且小鼠對炎癥刺激的耐受更強；3）由于ADA的產(chǎn)生，研究持續(xù)時間受到限制，畢竟ADA的發(fā)生率很高。

輝瑞公司的Cris Kamperschroer博士分享了一個通過藥理學(xué)手段影響食蟹猴中細(xì)胞因子釋放和T細(xì)胞活性的案例。采用一種CD3/TAA雙抗，含有去除效應(yīng)功能的Fc，該TAA在上皮細(xì)胞和漿膜細(xì)胞中表達。為減輕細(xì)胞因子的影響，研究采取了三種方法：1）抗IL-6單抗；2）Janus激酶抑制劑（JAKi）；3）糖皮質(zhì)激素藥物地塞米松（DEX）。均在CD3雙抗給藥前開始使用。研究終點包括血清細(xì)胞因子水平、與細(xì)胞因子釋放相關(guān)的臨床癥狀（如嘔吐、活動減少和弓背）以及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的急性期蛋白CRP。還評估了T細(xì)胞激活相關(guān)標(biāo)志物如外周和脾臟CD8+ T細(xì)胞上的CD69表達以及可溶性CD25水平，以及對TAA陽性細(xì)胞的預(yù)期殺傷作用。結(jié)果顯示，JAKi或DEX降低了某些細(xì)胞因子（如IL-6和IFN-γ）的水平，并減輕了與細(xì)胞因子釋放相關(guān)的臨床癥狀，而抗IL-6單抗則沒有這種效果。盡管看到了抗IL-6單抗的藥理學(xué)相關(guān)PD指標(biāo)變化（表現(xiàn)為沒有誘導(dǎo)CRP升高，因為IL-6誘導(dǎo)CRP），但其對細(xì)胞因子釋放的影響較弱，這與臨床上采用抗IL-6受體（IL-6R）抗體（如托珠單抗）治療細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）的效果相反。

在T細(xì)胞激活方面，只有JAKi抑制了T細(xì)胞上可溶性CD25和CD69的上調(diào)。組織病理學(xué)評分顯示，所有細(xì)胞因子阻斷劑均未避免TAA表達細(xì)胞的損傷的出現(xiàn)。總結(jié)來說，JAKi和DEX在抑制細(xì)胞因子釋放和防止細(xì)胞因子相關(guān)臨床癥狀方面是有效的，而抗IL-6單抗則無效。所有細(xì)胞因子阻斷劑未影響T細(xì)胞對組織中表達TAA細(xì)胞的活性，但JAKi抑制了T細(xì)胞激活標(biāo)志物的上調(diào)。

正是由于JAKi也影響了T細(xì)胞激活，因此DEX被認(rèn)為是預(yù)防CRS的最佳選擇，既降低細(xì)胞因子相關(guān)毒性，又不影響T細(xì)胞激活和殺傷。當(dāng)然，本研究的目的是評估在臨床上治療或預(yù)防CRS的潛在選擇。由于毒理研究的目的是表征分子的潛在安全性風(fēng)險，這其中就包括與細(xì)胞因子釋放相關(guān)的風(fēng)險，因此不推薦在非臨床毒理研究中進行藥理學(xué)手段的干預(yù)，這本身就會引入新的變量，使整項研究更為復(fù)雜。還是建議采用Janssen 的Shoba Shetty博士推薦的動物體內(nèi)劑量遞增方案。

來自Janssen的Chidozie (Dozie) Amuzie博士討論了接受CD3雙抗治療的食蟹猴中觀察到的組織病理學(xué)變化。伴隨CRS癥狀的食蟹猴，鏡下發(fā)現(xiàn)包括多器官的單核細(xì)胞浸潤和血管炎癥。其中，血管炎癥不應(yīng)與血管和血管周圍免疫細(xì)胞浸潤混淆。TCE免疫細(xì)胞浸潤位于小至中等大小動脈的周圍和壁內(nèi)。這與由單克隆抗體或反義寡核苷酸誘導(dǎo)的血管炎癥所觀察到的血管壁增厚或破壞明顯不同。

Amuzie還分享了一些與CD3雙抗相關(guān)的特定組織中的免疫細(xì)胞浸潤案例。例如，一些非CD19靶向的CD3雙抗，觀察到腦部單核細(xì)胞浸潤（MNCI）。雖然在對照動物中也可以觀察到MNCI，但通常位于蛛網(wǎng)膜下腔和腦膜的軟腦膜之間，而CD3雙抗對應(yīng)的MNCI深入腦實質(zhì)和神經(jīng)纖維中，且浸潤更為密集。通過原位雜交技術(shù)鑒定，腦部的MNCI主要由T細(xì)胞組成。不過，這些動物并未表現(xiàn)出任何神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的癥狀。

腎上腺是另一個需要關(guān)注的器官，尤其是出現(xiàn)嚴(yán)重急性反應(yīng)的動物，皮質(zhì)中觀察到有中性粒細(xì)胞浸潤，并與細(xì)胞因子釋放相關(guān)。當(dāng)使用不同的給藥方案（如增加給藥頻率）時，腎上腺髓質(zhì)中可以看到密集的MNCI。其他在較高不耐受劑量下觀察到鏡檢變化的器官主要是腎臟和肺。腎小管變性/再生最早可在初次給藥后24小時內(nèi)檢測到。當(dāng)然，腎臟毒性的最終定性還要結(jié)合BUN或肌酐等其它指標(biāo)綜合判定。

無毒理學(xué)研究相關(guān)動物種屬的考量

Immatics公司的Frank Schwöbel博士回顧了該公司CD3雙抗的非臨床研究策略。這種雙抗由抗CD3 scFv（單鏈抗體片段）和識別腫瘤抗原肽/白細(xì)胞抗原（HLA）復(fù)合物的單鏈TCR（scTv）組成。Immatics的XPRESIDENT平臺擁有一個龐大的肽-HLA信息數(shù)據(jù)庫，能夠揭示40多個不同器官腫瘤與正常組織之間所遞呈的肽段差異。由于HLA具有高度的種屬特異性，傳統(tǒng)的體內(nèi)動物研究并不適用于臨床前安全性評估。Immatics曾考慮使用HLA-A*02轉(zhuǎn)基因小鼠，但發(fā)現(xiàn)這些小鼠有以下不足：1）抗原處理的差異；2）人與動物蛋白序列的差異；3）人與動物基因表達譜的差異。因此，臨床前安全性評估主要基于計算機模擬（in silico）和體外（in vitro）測試。比如，會評估雙抗對正常組織上表達的相似序列肽段的潛在交叉反應(yīng)性，以及與TCR結(jié)合相似肽段的交叉反應(yīng)性。此外，還會針對靶點陰性的腫瘤細(xì)胞和原代健康組織細(xì)胞panels進行功能測試。這些數(shù)據(jù)與針對靶點陽性腫瘤細(xì)胞的體外藥效實驗結(jié)果進行比較，以計算治療窗口。

Immunocore的Joseph Dukes博士分享了該公司開發(fā)的CD3 TCE，也是由抗CD3 scFv和識別MHC/抗原肽（pMHC）的TCR組成。CD3結(jié)合域具有納摩爾級別的親和力，而pMHC結(jié)合域經(jīng)過親和力成熟，達到皮摩爾級別的親和力，旨在能夠識別細(xì)胞表面極低數(shù)量（10-100個）的表位。

由于CD3和pMHC結(jié)合域均只針對人，沒有合適的毒理相關(guān)種屬。Immunocore曾考慮使用HLA轉(zhuǎn)基因小鼠，但情況與Immatics遇到的類似，由于肽段中常見的跨種屬點突變（通常會破壞TCR結(jié)合），以及數(shù)據(jù)顯示轉(zhuǎn)基因小鼠中超過60%的HLA呈遞肽段缺失，使得在該模型中評估pMHC結(jié)合域的特異性沒有價值。因此，Immunocore開發(fā)了一套基于人類的in silico和in vitro的測試方案，用于預(yù)測臨床安全性和特異性。In silico方案利用內(nèi)部數(shù)據(jù)庫中的pMHC肽段，評估特定TCR與其他pMHC的潛在交叉反應(yīng)性。體外安全測試方案包括對約100種細(xì)胞系（覆蓋約20個器官的50-60種組織類型）進行了測試，如評估異體反應(yīng)性、血小板激活、全血中的細(xì)胞因子釋放以及正常人類組織中目標(biāo)肽段和蛋白的表達。

大部分安全性測試涉及使用原代細(xì)胞、人T細(xì)胞和TCE分子進行共培養(yǎng)，并建立合適的檢測指標(biāo)，如T細(xì)胞激活、IFN-γ或顆粒酶B的產(chǎn)生，或靶細(xì)胞殺傷。這些體外實驗還用于基于MABEL法確定首次人體（FIH）劑量。

首個進入臨床開發(fā)的分子是IMCgp100，其靶向由HLA-A*0201呈遞的gp100280-288肽段，該肽段在正常皮膚和眼睛的黑色素細(xì)胞以及黑色素瘤（尤其是葡萄膜黑色素瘤）中表達。體外數(shù)據(jù)顯示，在1納摩爾濃度下藥物無脫靶效應(yīng)，最大藥理效應(yīng)出現(xiàn)在100皮摩爾濃度，MABEL被確定為1皮摩爾。針對正常黑色素細(xì)胞的活性預(yù)計在皮摩爾范圍內(nèi)，基于本品的作用機制，預(yù)計會出現(xiàn)皮膚毒性以及細(xì)胞因子介導(dǎo)的促炎反應(yīng)。實際上，在葡萄膜黑色素瘤的I期臨床試驗中觀察到的毒性與預(yù)期一致，包括皮疹、瘙癢、細(xì)胞因子釋放、發(fā)熱、低血壓、惡心和疲勞。此外，隨著重復(fù)給藥，毒性有所降低，因此實施了患者內(nèi)劑量遞增，以實現(xiàn)更高暴露量，保障療效。值得一提的是，盡管眼睛中存在目標(biāo)靶點，臨床上尚未觀察到葡萄膜炎。本品已經(jīng)獲批上市。

Roche的Estelle Marrer-Berger博士也分享了pMHC/CD3這類分子in silico和in vitro評價方法的使用。與前述內(nèi)容，大同小異，不再贅述。

細(xì)胞因子釋放體外測試

TGN1412是一種CD28超激動劑，在2006年3月進行的健康志愿者I期臨床試驗中，所有受試者均出現(xiàn)了嚴(yán)重的、危及生命的CRS，部分患者進展為多器官功能衰竭。這一事件引發(fā)了廣泛關(guān)注，并推動了體外細(xì)胞因子釋放（CRA）試驗方法的開發(fā)，并成為TCE分子IND enabling階段必須要開展的關(guān)鍵研究之一。

楊森公司的Daniel Weinstock博士稱，楊森最初為所有在研的抗體類生物藥物開發(fā)了一種固相法，檢測CRA。然而，這種方法并不適用于CD3雙抗，因為CD3能夠有效交聯(lián)，固定化的CD3雙抗檢測通常呈陽性，無論靶細(xì)胞是否存在。為了克服這一問題，楊森開發(fā)了一種新的液相法，使用稀釋1:10的人全血進行檢測。在該實驗中，如果全血中有TAA表達，CD3雙抗會引發(fā)濃度依賴性的細(xì)胞因子釋放反應(yīng)。也可以考慮將細(xì)胞因子釋放檢測納入細(xì)胞毒性實驗中開展。

安進公司的Matthias Friedrich博士分享了該公司在CRA方面的經(jīng)驗。他指出，在使用分離的人T細(xì)胞進行的實驗中，無論是液相法還是固相法，在沒有靶細(xì)胞的情況下均未引發(fā)CRS。安進公司目前傾向于在T細(xì)胞依賴性細(xì)胞毒性（TDCC）實驗中測量細(xì)胞因子釋放。實驗中使用了人和食蟹猴的效應(yīng)細(xì)胞，如果可行，會使用患者來源的腫瘤細(xì)胞和自體T細(xì)胞（如TAA表達外周血）進行檢測。但體外試驗的人體預(yù)測能力有限，猴體內(nèi)細(xì)胞因子釋放與人體更相關(guān)。

然而，有與會者提出，對于CD3雙抗，細(xì)胞因子釋放是其預(yù)期的藥理學(xué)作用的一部分。既然如此，為何要對已知的且風(fēng)險明確的分子進行風(fēng)險識別檢測？FDA的一位代表表示，只要風(fēng)險已知且在其他研究（藥理學(xué)或毒理學(xué)）中得到確認(rèn)，則無需進行單獨的CRA。另一位FDA代表指出，當(dāng)T細(xì)胞激活的原因不明時，通常會要求對免疫調(diào)節(jié)劑進行CRA，而CD3雙特異性抗體的細(xì)胞因子釋放風(fēng)險已知，因此通常不需要類似Stebbings-like的CRA。