目前在研的免疫調節藥物數量逐日劇增，形式也豐富多樣，比如單抗、雙抗、基因修飾T細胞、免疫-藥物偶聯物、基因治療等等。所有這些藥物多多少均涉及到免疫毒性評價。

眾所周知，ICH S8是主要介紹人用藥物免疫毒性研究的指導原則。不過，該指導原則頒布距今18年，已經不能完全滿足工業界的需求。ICH S8于2006年頒布時，工業界開發的免疫藥物主要為免疫抑制方向，藥物形式也以小分子化藥為主。時過境遷，現如今是個百花齊放的時代，生物藥物爆發式增長，腫瘤免疫治療已經成為時代新寵，其它細胞和基因治療藥物的研發也如火如荼。這些新的藥物形式是不是適用于ICH S8，如果適用，需要開展哪些研究，都需要指南給出更具體的建議。

2023年，FDA出臺了新的免疫毒性研究指南（Nonclinical Evaluation of the Immunotoxic Potential of Pharmaceuticals）。不過，依然未能解決新分子形式藥物免疫毒性研究需要開展哪些測試以及監管機構接受的終點是什么。

Pfizer、Seagen、Abbvie、Boehinger-Ingelheim、Takeda、Gilead、GSK等組成的Immunosafety Working Group of IQ/DruSafe對工業界免疫毒性研究的挑戰進行了一組調查，分享如下。

共16家藥企給予了反饋，其中13家是雇員超過萬人的企業，3家雇員1000-10000人企業。所有企業均一致認為免疫安全性研究是非臨床開發中的關鍵組成部分。開展免疫安全性研究的主要原因分為3類：1）患者安全性；2）評估在靶和脫靶作用；3）加深對作用機制的理解。

治療領域方面，免疫學/炎癥領域，100%藥企均會開展免疫毒性評價。腫瘤免疫治療領域，這一比例是15/16。非免疫治療抗腫瘤領域和抗感染領域這一比例就低很多，分別是8/16、3/16。

大部分企業（15或16/16）會在非臨床研究中加入以下毒理終點，用于免疫安全性評估，包括臨床癥狀、組織病理學、血液學、常規免疫表型、CRA（cytokine release assay）、血清細胞因子/趨化因子、T細胞亞群（活化T和記憶性T）、TDAR（T-cell-dependent antibody response，T細胞依賴抗體反應）。還有很多企業會開展額外的ex vivo研究。這些指標已經超過ICH S8中的常規毒性研究內容，包含了附加的免疫毒性研究。ICH S8和CDE于2024年1月最新出臺的《藥物免疫毒性非臨床研究技術指導原則》均指出，如果常規毒性研究提示存在免疫毒性，應根據觀察到的免疫學改變的性質和化合物類別相關的擔憂決定采用何種適用的附加免疫毒性試驗方法。推薦進行免疫功能研究，如TDAR。

缺少合適的臨床前模型、缺少合適的檢測方法、監管機構接受標準的不確定性、ADA結果的可轉化性是目前非臨床免疫毒性評價面臨的主要挑戰，其中缺少合適的動物模型排名最為靠前。關于這點，可能的原因有很多，比如靶點僅在人體表達，種屬間的靶點序列或結構相差太多。還有些靶點僅在疾病狀態下表達，而非臨床研究主要采用健康動物開展。比如CD28激動劑TGN1412，猴中的耐受性良好，臨床則出現嚴重的細胞因子風暴，與CD28靶點在動物和人體中的表達差異有關，導致非臨床向臨床轉化出現問題。

重點介紹下TDAR和CRA。

TDAR

有些朋友可能對TDAR這個概念還不熟悉。TDAR主要用于免疫系統整體功能性評估。通常是對動物注射高免疫原性的蛋白如KLH，檢測抗KLH抗體，判斷機體免疫狀況。從免疫原識別到抗體產生，體內經歷了巨噬細胞/DC細胞和/或B細胞的抗原遞呈功能、輔助T淋巴細胞激活、B淋巴細胞抗體產生等一系列免疫過程，是檢測免疫抑制作用的重要方法之一，也可用于檢測免疫增強作用。TDAR可單獨開展，也可伴隨在重復給藥毒性試驗中考察。

14/16企業反饋會把TDAR包含在非臨床研究中。傳統認為TDAR主要用于檢測免疫抑制，不過已經越來越多用于免疫激活或免疫增強作用的評估。TDAR數據對于解釋藥物的藥理學和免疫毒理學，及臨床風險轉化方面非常有價值。

那么如何對TDAR的adversity進行定性呢？10/14企業是將TDAR出現的供試品相關的改變和組織病理學檢查結果作為確定adversity的主要依據。也有很多企業將TDAR改變與血液學和免疫表型之間的相關性進行分析，作為判定adversity的依據之一。其它考量因素還包括臨床癥狀、ex vivo功能性試驗終點、總的證據權重分析等。TDAR結果可以用于提示臨床風險。比如臨床前出現TDAR結果異常，臨床方案中安全性需監測感染風險、考慮對疫苗接種的影響等。

TDAR通常不單獨用于在毒理學研究中確定NOAEL。即使TDAR結果變化幅度顯著，但其它毒理結果未見變化，通常也不影響NOAEL的確定。然而，當TDAR的變化幅度與其他參數變化（包括組織病理學、血液學和免疫表型終點）同時存在時，可以基于TDAR的變化幅度進行NOAEL的判斷。

CRA

14/15的企業會將CRA包括在免疫毒性評價中。具體到哪些藥物形式需要開展CRA研究，如下圖所示。占比最高的原因是基于合理性考量，比如靶點表達在免疫細胞表面。其它原因包括新型生物制品、免疫檢查點抑制劑、新的生物藥物聯合、基因工程修飾的T細胞治療等。國內CDE出臺的《藥物免疫原性研究技術指導原則》明確提出，對于免疫調節類藥物，除了在動物體內檢測細胞因子外，還需要開展體外細胞因子釋放試驗。不過，CDE《藥物免疫毒性非臨床研究技術指導原則》也有提到，當藥物不直接結合到參與免疫系統激活的表面受體時，通常不需進行細胞因子釋放試驗。關于這點，指導原則沒有過多展開，個人理解如果藥物靶點不是免疫細胞表面的膜受體，比如是一些游離可溶性靶點，體外CRA試驗可以不用開展？

CRA中檢測最多的細胞因子是IFNγ（15/15）、TNFα（15/15）和IL-6（14/15）。其次是IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、IL-12p70，占比9/15，說明大部分企業會檢測以上細胞因子。當然，絕大多數企業（14/15）還會根據供試品的藥理學作用，增加特異性細胞因子檢測。大部分企業用全血或PBMC進行細胞因子釋放的檢測。具體檢測模式選擇固相法還是液相法，沒有標準答案，大部分企業會根據靶點是否表達在免疫細胞表面、是不是可溶性靶點、是否需要交聯發揮作用、是否表達在內皮細胞等進行決策。國內CDE要求固相法和液相法均盡可能要考慮，檢測的細胞因子至少包括IFNγ、TNFα、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10。建議采用未被刺激的人源細胞、全血和/或其他基質進行評估。

關于CRA結果對于臨床的指導意義，首先大部分企業會用CRA的結果進行起始劑量計算，即MABEL法。CRA陽性結果會影響起始劑量安全因子設定及劑量爬升階段的劑間距設計。其它額外的臨床考量點還包括患者預處理、哨兵法設計等。

CRA的挑戰在于對結果的解讀。企業反饋排名最靠前的是如何解釋CRA結果的臨床相關性。說的直白點，臨床前CRA中細胞因子的升高，臨床一定會升高嗎？臨床前不升高，臨床一定不升高嗎？這中間的轉化效果和指導意義尚沒有統一的判斷標準。其次是CRA中細胞因子升高到什么濃度才會引起擔憂。不同機制免疫調節劑的免疫刺激作用是不同的，CD28激動型抗體明顯強于細胞因子，細胞因子大概率也比免疫檢查點抑制劑強。但很難判定具體某一因子升高到某一濃度，會引起比較大的擔憂。其它難點還包括如何分析數據（看趨勢還是進行統計分析）、如何選擇合適的陽性和陰性對照、聯合用藥如何考量、應該檢測哪些細胞因子/趨化因子等。

目前的CRA通常不用于對風險進行定量評估，因為缺乏數據分析的標準方法以及對其臨床相關性的理解。其他原因還包括治療靶點可能在健康志愿者的細胞中缺失，疾病狀態下免疫細胞的狀態可能不同，靶點表達水平在個體之間存在差異，而且這些檢測可能缺乏與其他生理系統的關鍵相互作用（在模擬整個生物體反應方面的局限性）。此外，患者血清或血漿中觀察到的細胞因子變化可能與體外CRA中觀察到的細胞因子變化不直接相關。雖然監管機構期望進行CRA，并且一旦發現陽性結果，則應在臨床研究中采取更謹慎的方法（如低起始劑量、緩慢增加劑量等），但其真正的非臨床預測價值尚不清楚。