1. 實驗原理

巨噬細胞身為機體免疫系統里的關鍵“守衛軍”，肩負著吞噬病原體、調節免疫應答以及維持組織穩態諸多重任。通過原代提取的方式，研究人員能夠繞開細胞系多次傳代后可能出現的遺傳特性改變、功能衰退這問題，直接從鮮活的生物體內精準抓取具備完整生物活性的巨噬細胞，為后續一系列實驗奠定基礎。

原代骨髓來源的巨噬細胞在未受到刺激時，通常呈圓形或橢圓形，其細胞大小不一，細胞核較小，多呈圓形或橢圓形，染色質疏松，有明顯的核仁。細胞質中常見到空泡和顆粒狀物質，這些結構與細胞的吞噬功能相關。

以下是以小鼠為例的巨噬細胞原代提取方法的詳細步驟和注意事項：

2. 實驗材料

實驗動物：C57BL/J小鼠

試劑：含10%FBS DMEM高糖培養基、75%乙醇、無菌PBS。

實驗器械：一次性注射器、手術器械、離心管、細胞培養板或培養瓶

3. 實驗步驟

3.1 小鼠取腿骨

1）小鼠麻醉與處死：麻醉小鼠，迅速、人道地采用脫臼法處死，遵循動物實驗倫理，減輕小鼠痛苦。

2）體表消毒：備好足量75%乙醇的燒杯，放入小鼠浸泡5min，充分消毒殺菌；隨后用干凈紙吸干體表多余酒精。

3）皮膚及關節處理：持消毒剪刀在小鼠背部剪一小口，徒手平穩撕開皮膚至小腿關節，剔除足關節與皮膚。

4）腿部取材、二次消毒：用消毒剪刀小心從大腿根部大轉子處拆解后肢，避免骨折；剔除肌肉，將腿骨置于75%乙醇培養皿浸泡5min。

5）超凈臺準備：5min到點，更換新乙醇培養皿，移入超凈臺，為后續實驗營造無菌條件。

3.2 BMDM細胞提取和誘導

1）腿骨預處理：將乙醇浸泡過的小鼠腿骨移至盛冷PBS的容器，浸沒腿骨，用PBS洗去骨表面乙醇，重復3次，確保洗凈。

2）骨髓吹出操作：分離洗凈的股骨、脛骨，消毒剪剪斷兩端；用1mL注射器吸取冷誘導培養基，對準斷端吹骨髓，反復吹洗約3次，至腿骨內無明顯紅色。

3）細胞分散與過濾篩選：用5mL移液槍輕柔吹打含骨髓細胞的培養基，分散細胞團塊；懸液過70μm細胞濾器，濾除雜質，轉移至15mL離心管。

4）離心及重懸處理：1500rpm/min離心5min，棄上清；加紅細胞裂解液重懸，靜置5min，再同轉速離心5min，棄上清；用冷誘導培養基重懸細胞沉淀。

5）細胞培養及培養基更換：按要求鋪板培養細胞，第三天換一半培養基，維持環境穩定；第五天全換新鮮培養基，滿足細胞生長分化需求；第七天細胞達可用狀態。

4. 注意事項

1）BMDM細胞生物學特性特殊，不可傳代。

2）胰酶消化常用于分離貼壁細胞，但不適用于BMDM細胞。因其蛋白水解活性會破壞細胞膜、關鍵蛋白，致使細胞失活，無法用于后續實驗，切勿用胰酶處理。

3）因傳代、胰酶消化受限，取用BMDM細胞建議用細胞刮刀刮。

4）BMDM細胞脆弱、對環境敏感，獲取后宜直接鋪板用于實驗，盡量別換培養容器。更換易造成物理擾動，引發細胞碰撞、拉扯，損傷細胞，干擾實驗結果。