自從1960s年代雙特異性抗體概念提出，到雜交瘤技術(shù)、knobs-into-holes技術(shù)的發(fā)展，TCE已經(jīng)取得了長足進(jìn)步，并陸續(xù)進(jìn)入市場，造福腫瘤患者。已經(jīng)獲批的TCE靶點(diǎn)包括CD3/CD20、CD3/BCMA、CD3/CD19、CD3/GPRC5D、CD3/DLL3等。典型的TCE結(jié)構(gòu)是個(gè)三聚合物，由TCE、T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞組成，通過T細(xì)胞激活，釋放炎癥因子和細(xì)胞毒性分子，殺傷腫瘤細(xì)胞。考慮到TCE的免疫激活特點(diǎn)，首次臨床起始劑量（FIH）選擇通常基于MABEL（minimal anticipated biological effect level）方法。MABEL方法主要采用的體外藥理學(xué)活性試驗(yàn)（pharmacological activity assays）終點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算。關(guān)于體外藥理學(xué)活性試驗(yàn)如何影響MABEL計(jì)算起始劑量，其實(shí)是有一些細(xì)節(jié)需要考慮的，并不是隨便選擇一個(gè)細(xì)胞試驗(yàn)的結(jié)果就拿來計(jì)算起始劑量。TCE免疫激動劑屬于高活性產(chǎn)品，起始劑量計(jì)算可能失之毫厘差之千里，過低會影響臨床進(jìn)度、成本和患者倫理，過高則會引入安全性風(fēng)險(xiǎn)。

可以從六個(gè)變量著手分析：1）靶細(xì)胞來源和靶點(diǎn)表達(dá)水平；2）效應(yīng)細(xì)胞來源；3）效靶比（E:T ratio）；4）孵育時(shí)間；5）試驗(yàn)終點(diǎn)選擇；6）ECx.

靶細(xì)胞來源和靶點(diǎn)表達(dá)水平

理想的靶細(xì)胞來源是什么？是原代細(xì)胞還是細(xì)胞系？還是不同細(xì)胞來源的靶細(xì)胞均可以？理論上，患者來源的細(xì)胞/腫瘤（patient-derived cells/tumors, PDCs）比細(xì)胞系（cell lines）在靶點(diǎn)表達(dá)水平、腫瘤異質(zhì)性和T細(xì)胞殺傷敏感性方面，與人體的相關(guān)性更強(qiáng)。如果采用靶點(diǎn)表達(dá)密度與臨床不相關(guān)的細(xì)胞系進(jìn)行計(jì)算，得到的劑量不一定適用于臨床目標(biāo)人群。但是，采用PDCs也有挑戰(zhàn)，一是來源問題，不易獲取；二是樣本間的變異，尤其是實(shí)體瘤。細(xì)胞系的優(yōu)勢是可獲得性、結(jié)果的均一性會更好。如果無法獲得PDCs，不得不使用細(xì)胞系時(shí)，需謹(jǐn)慎選擇有代表性的細(xì)胞，并考量靶點(diǎn)表達(dá)水平的生理相關(guān)性。

效應(yīng)細(xì)胞來源

應(yīng)該采用什么樣的效應(yīng)細(xì)胞開展TCE的體外活性研究呢？PBMC、全血、純化的T細(xì)胞還是活化的T細(xì)胞？通常來講，患者來源的PBMC含有更豐富的免疫細(xì)胞分類，比純化的或活化的T細(xì)胞更合適。全血包括所有的血液成分，如果某些靶點(diǎn)除了膜表達(dá)，還有一定比例的可溶性占比，那么采用全血作為效應(yīng)細(xì)胞，能提供更多的信息。這點(diǎn)我的理解是，某些膜靶點(diǎn)如BCMA，也會被酶或者其它方式切掉，產(chǎn)生一部分的游離可溶性靶點(diǎn)，而可溶性靶點(diǎn)也是可以結(jié)合TCE的。對于這類靶點(diǎn)，PBMC就不如全血的臨床相關(guān)性更強(qiáng)一些。當(dāng)然，采用全血作為效應(yīng)細(xì)胞的方法相較于PBMC，更具挑戰(zhàn)和難度。最理想的效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)該是患者來源的效應(yīng)細(xì)胞或患者腫瘤中駐留的T細(xì)胞，這類細(xì)胞代表了患者體內(nèi)真正的殺傷細(xì)胞，但這類效應(yīng)細(xì)胞的來源、變異面臨一些挑戰(zhàn)。另外，患者來源的PBMC雖然比健康人的效應(yīng)功能更弱，但與預(yù)期臨床活性卻更為相關(guān)。

關(guān)于靶細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞選擇對FIH起始劑量選擇的影響，有個(gè)不錯(cuò)的案例。Teclistamab是一款CD3/BCMA雙特異性TCE，采用MM.1R細(xì)胞系作為靶細(xì)胞，純化的健康人T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，效靶比為5:1，EC20作為計(jì)算依據(jù)，獲得的FIH起始劑量為0.3μg/kg。這一劑量其實(shí)有些過于保守，比teclistamab后續(xù)step-up首劑量60μg/kg低了200倍。后續(xù)回顧性分析發(fā)現(xiàn)，如果采用PDCs作為靶細(xì)胞，起始劑量至少可以提高10倍。如果采用患者PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞，效果則會更好。畢竟健康人的PBMC本身就可能比患者效應(yīng)功能更強(qiáng)，更何況是純化的T細(xì)胞。

效靶比（E:T ratio）

確定了靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，接下來的問題便是應(yīng)該設(shè)置什么樣的效靶比最為合適。效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞的比例越高，比如3:1、5:1、10:1，會影響EC50或EC20值，過高估計(jì)待測產(chǎn)品的活性，導(dǎo)致更低的起始劑量。并不是每個(gè)適應(yīng)癥對應(yīng)一個(gè)統(tǒng)一的效靶比，畢竟每個(gè)患者的免疫狀態(tài)和靶負(fù)荷不同。臨床比較常見的一個(gè)場景是患者經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)治療（以化療居多）后，免疫細(xì)胞大幅降低，之后腫瘤進(jìn)展，腫瘤負(fù)荷增加，形成的局面是效靶比明顯降低。另外，對于免疫細(xì)胞浸潤比較少的冷腫瘤，效靶比也很低。來自Genentech的Michael Z. Liao等人（2020），評估過一款治療胃癌的TCE產(chǎn)品，10:1和1:5的效靶比相比，獲得的FIH起始劑量低10倍。

解決效靶比的其中一個(gè)路徑是采用患者的腫瘤樣本進(jìn)行效靶比檢測，根據(jù)真實(shí)的效靶比情況設(shè)計(jì)體外活性試驗(yàn)方案。如果拿不到患者樣本，可以查詢有沒有公開文獻(xiàn)報(bào)道。

通常來講，血液瘤的效靶比較實(shí)體瘤更高，前者可以考慮1:1，后者則可以考慮1:5或者1:10，預(yù)期與臨床相關(guān)性更好。當(dāng)然，前提是1:1的效靶比在體外試驗(yàn)中能觀察到功能信號，即對設(shè)置的終點(diǎn)有響應(yīng)。如果因效靶比太低，導(dǎo)致劑量-反應(yīng)關(guān)系不明顯，可以借助定量系統(tǒng)藥理學(xué)（QSP）模型輔助進(jìn)行劑量-反應(yīng)關(guān)系預(yù)測。

孵育時(shí)間

靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的孵育時(shí)間決定了反應(yīng)是否達(dá)到了Emax，即最大效應(yīng)。時(shí)間點(diǎn)設(shè)置因TCE分子設(shè)計(jì)、靶點(diǎn)等而異。孵育時(shí)間過久會導(dǎo)致人為誤差，過度高估產(chǎn)品活性，影響起始劑量設(shè)計(jì)。可以通過表征不同時(shí)間點(diǎn)的活性，進(jìn)行動態(tài)評估，找到Tmax（time to max effect）。如果采用細(xì)胞因子作為體外試驗(yàn)的終點(diǎn)指標(biāo)，考慮到細(xì)胞因子隨時(shí)間延長，分泌增加，且體內(nèi)-體外相關(guān)性尚不完全清楚。故，通常建議細(xì)胞因子的檢測，取早期時(shí)間點(diǎn)如24h或48h更合適一些。

試驗(yàn)終點(diǎn)選擇

TCE常見的體外活性終點(diǎn)包括T細(xì)胞激活（CD69+、CD25+）、細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子釋放等。哪個(gè)終點(diǎn)用于MABEL計(jì)算相關(guān)性更好？如果T細(xì)胞激活或者細(xì)胞毒性作為最敏感的終點(diǎn)還好，倒沒有太多講究。唯一需要提醒的是，如果效靶比太低，以細(xì)胞毒性作為試驗(yàn)終點(diǎn)，劑量-反應(yīng)關(guān)系的獲得可能是個(gè)挑戰(zhàn)。CD25和CD69的區(qū)別是，CD69作為T細(xì)胞激活的early marker，用于測定給予起始劑量后的early activity，相關(guān)性更好。

如果采用細(xì)胞因子作為終點(diǎn)指標(biāo)，卻是有一些注意事項(xiàng)需要考慮。細(xì)胞因子是白介素、干擾素、腫瘤壞死因子等一系列小分子蛋白質(zhì)或多肽的混合物。其中IL-6和其他促炎因子（如IL-1b）與CRS機(jī)制最為相關(guān)。選擇細(xì)胞因子作為試驗(yàn)終點(diǎn)的挑戰(zhàn)性體現(xiàn)在兩點(diǎn)，一是受不同donor個(gè)體間的高變異影響，二是細(xì)胞因子是一組組合物，單一細(xì)胞因子的意義有限，最好能看到關(guān)鍵細(xì)胞因子的共同升高，如TNF-α、IFN-γ、GM-CSF、IL-1、IL-6。比如CD3/GPRC5D雙抗talquetamab，發(fā)現(xiàn)IL-10是最敏感的試驗(yàn)終點(diǎn)，EC20為0.032nM。考慮到其他細(xì)胞因子的升高水平不如IL-10那么敏感，且個(gè)體間變異很大，最后選擇了T細(xì)胞激活標(biāo)志物CD25作為起始劑量計(jì)算依據(jù)，較IL-10計(jì)算的劑量高2.5倍。CD3/CD20雙抗odronextamab則不同，本品體外活性觀察到TNF-α、IFN-γ、IL-6均升高，且EC50介于0.3-0.5nM，敏感度類似。

ECx

所謂ECx，是指選擇EC20、EC30還是EC50作為計(jì)算依據(jù)。毫無疑問，EC20、EC30獲得的劑量會更為安全，同時(shí)也意味著比較保守。大部分TCE，采用EC50獲得的起始劑量是可以接受的。來自合適的體外藥理學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，F(xiàn)DA也同意采用EC50進(jìn)行MABEL計(jì)算。當(dāng)然，對于全新靶點(diǎn)，且有off-tumor表達(dá)，可以考慮采用更保守的EC20、EC30，其他情況可以考慮以EC50進(jìn)行計(jì)算。

案例

下表羅列了4個(gè)TCE雙抗的MABEL法計(jì)算FIH起始劑量的體外藥理試驗(yàn)特點(diǎn)。Teclistamab靶細(xì)胞除了細(xì)胞系，也采用了PDCs，且基于PDCs獲得的劑量與step-up劑量更為接近。可能出于安全性考慮，最終選擇的更保守的細(xì)胞系來源的數(shù)據(jù)。效應(yīng)細(xì)胞來源方面，健康人血樣可獲得性更強(qiáng)，用的最多。另外，效靶比偏高，5:1、10:1為主。孵育時(shí)間介于24-48h。試驗(yàn)終點(diǎn)細(xì)胞毒性、T細(xì)胞激活均可。Odronextamab也采用了細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6進(jìn)行了計(jì)算，且能得到更高，相關(guān)性更好的起始劑量。不過，很明顯，大多數(shù)TCE產(chǎn)品選擇了更為保守的策略。相信隨著TCE研究數(shù)據(jù)的積累，MABEL計(jì)算FIH起始劑量會更科學(xué)、更理性。