摘 要： 建立氣相色譜測定瓊脂糖微球中司盤85含量的分析方法。通過油酸濃度的換算得到司盤85的含量，以油酸為外標，用氣相色譜法進行定量分析。采用DB-FFAP 色譜柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm），載氣為氮氣，尾吹流量為30 mL/min，進樣口溫度為240 ℃，采用氫火焰離子化檢測器檢測，檢測器溫度為280 ℃，色譜柱流量3.0 mL/min，程序升溫。在該色譜條件下，各物質能有效分離，質量濃度在6～100 μg/mL 范圍內的線性關系良好，相關系數大于0.99，方法檢出限為6.75 μg/mL，定量限為11.25 μg/mL。樣品回收率為96.62%～98.84%，測定結果的相對標準偏差小于0.9%（n=6）。該方法克服了待測制劑中其他組分干擾的問題，進一步提高了檢測靈敏度和專屬性。

關鍵詞： 氣相色譜法； 瓊脂糖微球； 司盤85； 油酸

司盤85又名三油酸山梨坦，是山梨坦與三分子油酸形成酯的混合物，系山梨醇脫水，在堿性催化下，與三分子油酸酯化而制得，或由山梨醇與三分子油酸在180～280 ℃下直接酯化制得，被廣泛用作乳化劑、潤滑劑、潤濕劑、分散劑、增稠劑等，常用于食品、藥品、化妝品等領域[1]。

筆者選擇司盤85作為乳化劑用于制備瓊脂糖微球，攪拌使司盤85與油相充分混合，在乳化過程中油相與水相均勻而穩定地分散混合，從而獲得完整且表面形貌良好的球形[2?4]。制得的乳液經無水乙醇和純化水洗滌即可得到不含有機溶劑的潔凈瓊脂糖微球[5]。潔凈的瓊脂糖微球不僅可以作為介質，用于不同物質的分離和分析[6?7]，還可以作為載體，應用于醫藥領域[8]。依據目前中國藥典和新藥審批規定，需對藥物合成中的殘留溶劑進行控制，否則產品中的殘留溶劑可能會對人體產生危害[9]。司盤85作為一種有機溶劑，其殘留量的檢測至關重要。

目前，司盤類試劑的檢測方法有滴定法、薄層色譜分析方法、高效液相色譜法和氣相色譜法。其中，薄層色譜分析方法與滴定法精確度差，適用于定性分析[10]；液相色譜法的靈敏度差，檢測過程中出現多個色譜峰，多個色譜峰之間的分離度較差[11]；氣相色譜法檢測司盤類試劑的處理過程復雜，耗時較長[12]，因此需要一種簡單快速檢測司盤類試劑的方法。《中華人民共和國藥典》（2020年版）四部建議根據脂肪酸組成評估司盤85的含量，但該方法所用對照品較多且操作復雜。

依據油酸在脂肪酸中占比65%~88%，脂肪酸在司盤85中占比85.5%~90%，計算得到油酸在司盤85中占比為0.555~0.792。以油酸為外標，利用氣相色譜法檢測瓊脂糖微球中油酸濃度，再計算出微球中司盤85含量，該方法不僅簡便、快速，克服了待測制劑中其他組分干擾的問題，進一步提高了檢測靈敏度和專屬性。

1. 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

精密電子天平：PX224ZH/E型，感量為0.1 mg，奧豪斯儀器（常州）有限公司。

氣相色譜儀：島津-GC2014C型，配有氫火焰離子化（FID）檢測器，日本島津有限公司。

數顯恒溫水浴鍋：HH-1型，常州丹瑞實驗儀器設備有限公司。

油酸：質量分數不低于98%，江西佰草源生物科技有限公司。

甲醇：色譜純，質量分數不低于99.9%，國藥集團化學試劑有限公司。

三氟化硼甲醇溶液：10%，上海麥克林生化科技有限公司。

氫氧化鉀、正己烷、氯化鈉：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

高純氮氣：質量分數為99.999%。

瓊脂糖微球樣品：批號分別為20240108、20240319、20240408，自制。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：DB-FFAP，硝基對苯二甲酸改性的聚乙二醇強極性色譜柱[30 m×0.32 mm，0.5 μm，安捷倫科技（中國）有限公司]；檢測器溫度：280 ℃；載氣：高純氮氣，流量為30 mL/min；進樣口溫度：240 ℃；進樣方式：分流進樣，分流比為38∶1；柱升溫程序：初始溫度為 150 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升溫至220 ℃，保持10 min；平衡時間：3.0 min；進樣量：1 μL。

1.3 溶液的制備

油酸標準溶液：稱量油酸標準品0.01 g于50 mL離心管中，加入0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液4 mL，加入10%三氟化硼甲醇溶液7 mL，加正己烷5 mL，加入10 mL飽和氯化鈉溶液，搖勻，靜置分層后分別取上層液，獲得標準溶液。

油酸系列標準工作溶液：分別移取油酸標準溶液30、40、50、100、200、500 μL于10 mL容量瓶中定容，混勻，用0.22 µm濾膜過濾，制備得油酸的質量濃度分別為6、8、10、20、40、100 μg/mL的系列標準工作溶液。

瓊脂糖微球：稱取4.8 g瓊脂糖粉末于160 ml純化水中，121 ℃滅菌15 min，使瓊脂糖粉末充分溶解，作為水相備用。稱取20 g司盤85于300 g液體石蠟中，在60 ℃的水浴鍋中攪拌30 min，使司盤85與液體石蠟充分混合，作為油相備用。將油相倒入水相中，在60 ℃的水浴鍋中進行乳化均質，均質5 min后停止反應，攪拌槳攪拌30 min降溫至室溫。乳化結束后，將反應液倒入含有乙酸乙酯-乙醇（體積比為7∶3）的清洗液中進行攪拌清洗3次，離心后繼續用純化水清洗3次，篩網過濾得瓊脂糖微球[5]。相同方法制備3批瓊脂糖微球。

供試品（瓊脂糖微球）溶液：精確取瓊脂糖微球2.0 g，加入0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液4 mL，在65 ℃水浴中回流10 min，放冷，加入10%三氟化硼甲醇溶液7 mL，在65 ℃水浴中加熱回流2 min，放冷，加正己烷5 mL，繼續回流1 min，放冷，轉移至50 mL離心管中，加入10 mL飽和氯化鈉溶液，搖勻，靜置分層取上層液，過濾，獲得供試品溶液。

1.4 實驗步驟

使用氣相色譜儀按照1.2儀器工作條件檢測油酸系列標準工作溶液，以溶液質量濃度為橫坐標、色譜峰面積為縱坐標進行線性回歸，建立油酸的標準曲線；同法檢測樣品溶液，利用色譜峰面積外標法計算出樣品中油酸的質量濃度，將所得油酸濃度帶入式（1）計算瓊脂糖微球樣品中司盤85含量：

(1)

式中：ρ——樣品中司盤85含量，μg/mL；

ρ0——樣品中油酸濃度，μg/mL；

w——司盤85中油酸質量分數，0.555～0.792；

m——稱取的樣品質量，g。

2. 結果與討論

2.1 脂肪酸衍生方法的選擇

大多數脂肪酸沸點較高，且在高溫條件下不穩定、易裂解，分析過程中容易造成損失，因此需要對脂肪酸進行衍生化處理后才能定量分析[13]。目前常用的衍生化方法主要有酸催化法、堿催化法和重氮甲烷法[14]，而由于重氮甲烷法毒性較強，濃度較高時易發生爆炸，堿催化法易使脂肪酸失去活性，因此選擇酸催化法對脂肪酸進行衍生化處理。根據《中華人民共和國藥典》（2020年版）四部選擇三氟化硼甲醇溶液對脂肪酸進行甲酯化處理。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

目前常用于脂肪酸甲酯化檢測的色譜柱為極性固定相色譜柱，比較了聚乙二醇（DB-FFAP）與(88%-氰丙基)芳基-聚硅氧烷（HP-88）對脂肪酸甲酯分離效果。通過試驗發現HP-88色譜柱檢測時間較長，而DB-FFAP色譜柱對油酸的分離效果較好且檢測時間較短，因此選擇DB-FFAP色譜柱進行試驗。

2.2.2 載氣流量的選擇

由速率理論可知，載氣流量快慢會影響樣品中組分分離效果以及峰型，如過高的載氣流量會使組分流失，影響測定的靈敏度，過低的載氣流量會造成峰拖尾現象[15]。一般載氣流量的選擇范圍為10～100 mL/min。根據多次試驗結果和實際色譜柱柱效表明，選擇30 mL/min的載氣流量為最適流量。

2.3 標準品處理方法調整

根據《中華人民共和國藥典》檢測三油酸山梨坦的方法，將油酸標準品進行冷凝回流和未回流處理。結果顯示，經回流處理的油酸峰面積比未經回流處理的峰面積低，說明冷凝回流會造成標準品的部分損失，故采用不回流的處理方式進行標準品的制備。

2.4 專屬性試驗

精密量取油酸標準溶液、樣品溶液、供試品溶液各1 mL，按照1.4實驗步驟進行檢測，各溶液的色譜圖見圖1。

  1—供試品溶液；2—標準溶液；3—樣品溶液圖1　油酸標準溶液、供試品溶液和樣品溶液的色譜圖

Fig. 1   Chromatograms of oleic acid standard solution、test sample - standard solution and sample solution

由圖1可知，3種溶液的保留時間均在同一位置，在目標峰出現的位置確屬于待檢測的油酸峰，證明該方法的專屬性很高，檢測過程中不會出現雜峰的干擾。

2.5 線性關系、檢測限與定量限試驗

按照1.4方法檢測油酸系列標準工作溶液，并計算線性方程和相關系數。結果表明，油酸質量濃度在 6～100 μg/mL范圍內與色譜峰面積線性關系良好，線性方程為y=93.973x-304.67，線性相關系數為0.999 2。

以3倍信噪比對應的油酸質量濃度確定檢測限為6.75 μg/mL，以10倍信噪比對應的油酸質量濃度確定定量限為11.25 μg/mL。

2.6 精密度試驗

配制6份凝膠樣品溶液，按1.4實驗步驟進行檢測，考察微球樣品油酸含量和保留時間的相對標準偏差，試驗結果見表1。由表1可知，樣品中油酸含量測定結果的相對標準偏差為2.92%，保留時間的相對標準偏差為0.07%，表明該方法的重現性很好，具有很高的精密度，能夠滿足定量分析的要求。

表1   精密度試驗結果

Tab. 1   Precision test results

2.7 穩定性試驗

取1份樣品溶液，分別在 0、2、4、6、12、24 h進樣測定，試驗結果見表2。

表2   穩定性試驗結果

Tab. 2   Stability test results

由表2可知，油酸峰面積測定結果的相對標準偏差為0.87%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 回收率試驗

稱取已知組分含量的透明質酸凝膠樣品溶液，用標準加入法分別測定20、25、30 μg/mL 3個加標水平下油酸的回收率，每組樣品6份，試驗結果見表3。由表3可知，油酸平均回收率為96.62%～98.84%，表明該方法的準確度很高，滿足樣品的分析要求。

表3   回收率試驗結果

Tab. 3   Recovery rate test results

2.9 樣品測定

取適量樣品，按照1.3方法制備供試品溶液，在1.2儀器工作條件下測定，計算司盤85含量。結果批號為20240108、20240319、20240408的樣品中均未檢出司盤85試劑殘留。

3. 結語

通過優化對油酸標準品的處理，利用氣相色譜儀對含有司盤85的待測樣品進行檢測。以油酸為標準品，正己烷為溶劑，通過油酸含量換算得到司盤85的含量。與《中華人民共和國藥典》（2020年版）四部相比，該檢測方法簡化了制備步驟，檢測快速，線性良好，克服了待測制劑中其他組分干擾的問題，增強了專屬性，對司盤85含量檢測具有重要意義。

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引用本文： 王寶群，史宇涵，林莎莎，等 . 氣相色譜法測定瓊脂糖微球中司盤85［J］. 化學分析計量，2024，33（12）：78. (WANG Baoqun, SHI Yuhan, LIN Shasha, et al. Determination of Span-85 in agarose microspheres by gas chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(12): 78.)