本研究旨在建立一種同時(shí)測(cè)定婦科養(yǎng)榮丸（主要成分為當(dāng)歸、川芎、杜仲、陳皮等）中綠原酸、京尼平苷酸、芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷、松脂醇二葡萄糖苷含量的方法。采用的方法是通過甲醇提取液的分析，使用Eclipse XDB-C18色譜柱（450mm×4.6mm，5μm）進(jìn)行分離；流動(dòng)相為甲醇 -0.1%磷酸溶液，采用梯度洗脫；流速設(shè)定為1.0mL/min ；柱溫保持在30℃ ；進(jìn)樣量為5μl；檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。結(jié)果顯示，這6種成分在各自檢測(cè)范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)r≥0.9995），平均加標(biāo)回收率為98.71%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于1.3%。因此，本研究所提出的分析方法準(zhǔn)確可行，適用于婦科養(yǎng)榮丸（濃縮丸）的質(zhì)量控制。

 

婦科養(yǎng)榮丸（濃縮丸）由當(dāng)歸、酒白芍、熟地黃等十六味藥材制成，具有補(bǔ)養(yǎng)氣血，疏肝解郁，祛瘀調(diào)經(jīng)等功效。它主要用于治療氣血不足、血漏血崩，貧血身弱及不孕癥 [1]。在臨床上，婦科養(yǎng)榮制劑也常用于更年期功能性子宮出血、原發(fā)性卵巢功能不全、不孕癥等疾病的聯(lián)合治療 [2-4]。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收錄于《中藥成方制劑》第十五冊(cè)，該標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了顯微鑒別；現(xiàn)收載于《中國(guó)藥典》2020 版一部，增加了當(dāng)歸、川芎等薄層色譜鑒別，并對(duì)芍藥苷含量進(jìn)行了測(cè)定，規(guī)定每 1g 含白芍以芍藥苷計(jì)，不得少于 0.80 mg。在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，檢驗(yàn)項(xiàng)目單一化，難以全面把控制劑的整體質(zhì)量。目前，關(guān)于芍藥苷、橙皮苷等指標(biāo)性成分評(píng)價(jià)婦科養(yǎng)榮丸（濃縮丸）質(zhì)量的研究已有相關(guān)報(bào)道 [5-8]，但這些報(bào)道尚不夠全面。通過資料檢索發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸、川芎、白芍、杜仲等藥材均具有相應(yīng)的含量指標(biāo)性成分。近年來，一測(cè)多評(píng)作為快速發(fā)展的中藥質(zhì)量控制方法，因具備科學(xué)、準(zhǔn)確、應(yīng)用范圍廣、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑中得到了廣泛應(yīng)用 [9-18]。因此，本文采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)婦科養(yǎng)榮丸（濃縮丸）的質(zhì)量進(jìn)行研究，旨在為婦科養(yǎng)榮丸的整體質(zhì)量控制提供科學(xué)參考。

 

1.材  料

 

1.1儀器

 

Agilent 1260 型高效液相色譜儀，配備DAD檢測(cè)器（Agilent公司）；AUY220 型電子天平（精度達(dá)萬分之一，日本島津電子天平）；CPA225D 型電子天平（精度達(dá)十萬分之一，德國(guó)賽多利斯）；以及 KQ-500VDE 三頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

 

1.2試藥

 

對(duì)照品包括：京尼平苷酸（批號(hào)111828-201805，純度 98.1%）、綠原酸（批號(hào) 110753-202119，純度 96.3%）、芍藥苷（批號(hào) 110736-202145，純度94.6%）、 松脂醇二葡萄糖苷（ 批號(hào)111537-201706，純度 91.7%）、阿魏酸（批號(hào) 110773-201915，純度 99.4%）以及橙皮苷（批號(hào) 110721-202019，純度95.3%）。來源：中國(guó)食品藥品檢定研究院；婦科養(yǎng)榮丸 [仲景宛西制藥股份有限公司，批號(hào)分別為 20031、20032、20033、20034、20035、20036，規(guī)格為每瓶200丸（每 8 丸相當(dāng)于原生藥3g）] ；實(shí)驗(yàn)中使用的溶劑為色譜級(jí)甲醇和超純水，其他試劑均為分析級(jí)。

 

2.方法與結(jié)果

 

2.1色譜條件

 

色譜柱：Eclipse XDB-C18 柱（450 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）與 0.1% 磷酸溶液（B）進(jìn)行梯度洗脫；0-5 min，5%A；5-10 min，5%-15%A；10-17 min，15%-22%A；17-18 min，22%-25%A；18-25 min，25%A；25-28 min，25%-27.8%A；28-40 min，27.8%-32%A；40-55 min，32%-55%A；55-60 min，55%-90%A；60-70 min；90%A；波長(zhǎng)為230 nm；柱溫：30℃；流速為1.0 ml/min；進(jìn)樣量：5 μl。

 

2.2溶液制備

 

2.2.1 對(duì)照品溶液配制

取適量對(duì)照品，進(jìn)行精密稱定后，加甲醇溶解并搖勻，制得京尼平苷酸、綠原酸、芍藥苷、松脂醇二葡萄糖苷、阿魏酸、橙皮苷的對(duì)照品貯備液，其質(zhì)量濃度分別為 0.05480 mg/ml、0.16132 mg/ml、0.25840 mg/ml、0.07484 mg/ml、0.21876 mg/ml、0.56440 mg/ml。再取該貯備液 50 ml 置于 200 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得對(duì)照品溶液。

 

2.2.2 供試品溶液制備

 

取本品細(xì)粉 1g，置于 25ml 量瓶中，加入適量甲醇，超聲處理 30min后放冷，再用甲醇定容至刻度，充分振搖，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng) 0.45μm 濾頭過濾，即得。

 

2.2.3 陰性樣品溶液制備

 

取缺當(dāng)歸（含綠原酸、阿魏酸）、酒白芍（芍藥苷）、川芎（阿魏酸）、杜仲（松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸）、陳皮（橙皮苷）的剩余藥材，按照處方及工藝制備陰性樣品，再按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

 

2.3一測(cè)多評(píng)法測(cè)定各成分含量

 

2.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

 

精密吸取上述陰性樣品溶液、對(duì)照品溶液及供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果顯示，各成分有效分離且陰性對(duì)照無干擾，表明該方法專屬性良好。

 

圖1 高效液相色譜圖

 

2.3.2 線性關(guān)系考察

 

將對(duì)照品稀釋成 6 個(gè)不同濃度，分別取 5 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以C質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X， mg/ml）、S 峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表1。各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

 

表1 各成分線性關(guān)系

 

2.3.3 精密度試驗(yàn)

 

取對(duì)照品溶液 1 ml，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣 6 次。計(jì)算六種成分的峰面積 RSD 分別為 0.29%、0.82%、0.50%、0.86%、1.08%、0.18%，表明儀器精密度良好。

 

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

 

取批號(hào)為 20031 的樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備 6 份，以“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分含量 RSD分別為 0.62%、1.51%、0.82%、1.32%、1.40%、0.58%，表明該方法重復(fù)性良好。

 

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

 

取同一樣品溶液，在 0、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h 時(shí)分別進(jìn)樣，測(cè)定綠原酸、京尼平苷酸、芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷、松脂醇二葡萄糖苷的峰面積 , 計(jì)算 RSD分別為 1.14%、0.90%、1.27%、0.79%、1.10%、0.84%，表明溶液在 12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

 

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)

 

取批號(hào)為 20031 的樣品，研細(xì)后取 6 份，每份約 0.5 g，置 25 ml 容量瓶中，加入對(duì)照品溶液 10 ml，加甲醇適量，超聲處理 30 min，冷卻后加甲醇至刻度，搖勻，濾過，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率分別為97.77%、98.73%、99.26%、99.35%、98.27%、98.85%，RSD 分別為 1.21%、1.24%、0.88%、0.97%、1.04%、1.17%。

 

2.3.7 樣品含量測(cè)定

 

取 6 批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表2。

 

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

 

3.討  論

 

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

 

由于中藥方劑成分復(fù)雜，各成分的最大吸收波長(zhǎng)不同，本實(shí)驗(yàn)在190 nm ～ 400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果顯示，芍藥苷、阿魏酸、綠原酸、橙皮苷、松脂醇二葡萄糖苷和京尼平苷酸分別在 230 nm、310 nm、327 nm、283 nm、277 nm 和 254 nm 處有最大吸收。但通過對(duì)比幾種成分的全波長(zhǎng)掃描結(jié)果，發(fā)現(xiàn)它們?cè)?230 nm 處的峰面積減少較小。因此，選擇在 230 nm 處記錄色譜圖，并進(jìn)行 6 種成分的測(cè)定。

 

3.2流動(dòng)相選擇

 

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了乙腈 -0.1% 磷酸、甲醇 -0.1% 冰醋酸、甲醇 -0.1% 磷酸和甲醇 - 水作為流動(dòng)相，不同成分的分離效果及峰形。結(jié)果顯示，甲醇 -0.1% 磷酸作為流動(dòng)相時(shí)分離效果及峰形最佳。由于樣品成分復(fù)雜且各有效成分保留時(shí)間長(zhǎng)短不一，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定采用梯度洗脫方式進(jìn)樣，以實(shí)現(xiàn)各成分的有效分離。

 

3.3提取方法

 

參考《中國(guó)藥典》中樣品的處理方法，本實(shí)驗(yàn)分別采用了加熱回流和超聲波處理兩種方法進(jìn)行研究。研究發(fā) 現(xiàn)， 不 同 超 聲 提 取 時(shí) 間（30 min、45 min、60 min）提取率差異不明顯，30 min 時(shí)各成分已能有效提取；加熱回流（30 min、60 min）的提取效果與超聲提取的差異不大。為簡(jiǎn)化操作，選擇超聲波提取作為樣品處理方法。此外，通過改變不同提取溶劑發(fā)現(xiàn)，甲醇作溶劑時(shí)橙皮苷提取率最高，而使用含水的有機(jī)溶劑作為提取溶劑時(shí)，橙皮苷的損失較為明顯。而其他幾種成分受提取溶劑變化影響較小。

 

4.結(jié)  論

 

本文對(duì)婦科養(yǎng)榮丸（濃縮丸）中的 4 種藥材 6 個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行了定量分析，為該藥品的整體質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)，使整體質(zhì)量控制更加全面和合理，具有重要的參考價(jià)值。

 

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本文作者李磊1、張強(qiáng)1、景廷杰1、陳玉海1,2，1.仲景宛西制藥股份有限公司、2.河南省中藥固體制劑技術(shù)創(chuàng)新中心，李磊為本文第一作者，從事中藥生產(chǎn)質(zhì)量控制與研發(fā)，擔(dān)任仲景宛西制藥股份有限公司提取車間主任，僅供交流學(xué)習(xí)。