免疫組化（IHC）作為一種重要的實驗技術，被廣泛應用于病理學研究中。然而，實驗過程中常會遇到各種問題，如假陽性、假陰性等問題，嚴重影響實驗結果的準確性和可靠性。本文將結合實際操作經驗，詳細分析并總結免疫組化實驗中可能存在的問題及解決方法，幫助大家提高實驗成功率。

一、假陽性或背景高的處理

1. 降低一抗濃度

降低一抗的濃度至既能看到陽性表達又能明顯區分陽性區域與周圍間質時為止。如無法達到此效果，建議更換一抗。

2. 調整封閉條件

逐步提高封閉條件，從山羊血清到5%BSA+山羊血清，最終至5%脫脂奶。然而，通常調整至5%BSA+山羊血清即可，不建議輕易使用5%脫脂奶。

3. 二抗選擇

對于動物標本，選擇抗鼠或抗兔的二抗，避免使用通用型二抗，以免種屬間抗原抗體反應引起假陽性。

二、假陰性的處理

1. 抗原修復

確保使用正確的抗原修復方法，必要時查閱相關文獻。

2. 系統檢查

使用任何腫瘤類型的切片進行Ki-67染色，以判斷體系及二抗是否存在問題。若Ki-67染色陰性，需檢查以下步驟：

二甲苯酒精是否需要更換

PBS緩沖液的pH值是否正常

抗原修復液的使用及修復時間是否正確

3. 標本保存

避免使用保存時間過久的標本。石蠟切片應盡量放置于-20°C避光保存，標本保存超過三年往往影響染色效果。

三、設置對照

1. 自身對照

同一張組織切片中，癌和癌旁表達不同的區域可作為自身對照，以確認抗體表達的陽性或陰性為真。

2. 陽性對照

當陽性率過低或無陽性表達時，需做陽性對照，以確認標本陰性為真陰性。

3. 陰性對照

當標本染色陽性率過高時，需做陰性對照，以確認陽性表達并非由非特異性染色引起。

四、陽性對照的制備與選擇

1. 購置陽性對照

可從公司購置陽性對照片。

2. 選擇合適的陽性對照

根據抗體說明書選擇相應的陽性組織，如PD-L1選用人胎盤作為陽標。

3. 試染不同病例

根據文獻選擇表達率最高的病種，選擇5例不同的病例進行試染。

五、實驗中的注意事項

1. 抗原修復

微波修復需間隔進行，防止抗原修復液蒸發引起干片。

高壓鍋內需放置足量的抗原修復液，避免使用蒸餾水或自來水。

2. 一抗的配制

盡量使用抗體稀釋液配制一抗工作液，存儲不得超過一周，避免使用封閉液或BSA作為抗體稀釋液，以防影響一抗效價。

3. DAB顯色問題

DAB需現用現配，若非馬上使用可暫時避光保存。

顯色時需及時觀察切片上色情況，區域性黃染出現時即可終止顯色。

DAB顯色時間較短，一般數秒至1-2分鐘，超過5分鐘不上色需立即停止顯色。

4. 蘇木素復染問題

復染前需經蒸餾水清洗以保護蘇木素。

根據所用蘇木素類型選擇適當的分色方法，避免用錯分色液。

5. AEC顯色問題

AEC顯色用于某些特殊腫瘤，如惡性黑色素瘤，顯色時間較長，需20-30分鐘。

6. 蓋玻片處理

蓋玻片使用前需過酸處理，時間為數秒，然后置于流水中沖洗干凈。

7. 脫水封片

免疫組化染色結束后的切片脫水時間不需很久，每個缸數秒即可。

六、其他實驗細節

1. 實驗數量

一次實驗切片數量不宜過多，特別是初學者，以免時間差距導致結果不穩定。

2. 避免干片

實驗過程中避免干片，特別是初學者，寧可浪費一些試劑也不能出現干片情況。

3. 記錄與觀察

首次實驗必須做完整的實驗記錄，以便查找失敗原因，觀察時需先低倍后高倍，避免誤判。

4. 貼簽標明

注意貼簽，標明標本號、抗體名稱、稀釋倍數及日期，以便出現問題時查找原因。

通過以上總結，相信大家可以更好地應對免疫組化實驗中的各種問題，提高實驗成功率。希望本文能為各位讀者提供有價值的參考，助力科學研究順利進行。