一、原理

 

多重免疫組化（mIHC）是一種先進的技術，它允許在單個組織切片上同時檢測多個靶標。這項技術主要利用了酪胺信號放大技術（Tyramide signal amplification, TSA）。簡單來說，TSA技術是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記的酶學檢測方法。

 

 

TSA熒光染料是由酪胺分子(tyramine，T)和熒光染料偶聯(lián)而成。在過氧化氫(H2O2)環(huán)境中，非活性的酪胺分子(T)被二抗偶聯(lián)的HRP催化激活發(fā)生大量的酶促反應，成為具有短暫活性的中間態(tài)分子(T*)并形成共價鍵結合位點，與鄰近蛋白(包括靶抗原蛋白、一抗、二抗及HRP)的富電子區(qū)域(如色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)發(fā)生共價偶聯(lián)而沉積。

 

偶聯(lián)在酪胺分子上的熒光染料從而也在共價偶聯(lián)蛋白周圍大量沉積,使信號被有效放大。因為抗原—酪胺蛋白間的共價鍵鍵能的穩(wěn)定性遠高于抗原—抗體間的非共價鍵結合力，隨后通過微波修復洗掉結合在抗原上的一抗—HRP二抗—TSA染料復合物，只保留與抗原偶聯(lián)的TSA熒光染料信號。之后換不同靶蛋白抗體、換不同激發(fā)波長和發(fā)射波長的TSA染料進行第二輪孵育，周而復始，通過多輪復染即可實現(xiàn)組織的原位多靶點染色(最多可八標九色)。

 

二、HE染色評估組織質量

 

對所有樣本進行HE染色，評估取材、組織脫水、包埋、切片等步驟是否合格。

 

三、免疫組化測試一抗

 

先用陽性組織石蠟切片確定一抗有效濃度（設置低，中，高3個濃度梯度），根據(jù)染色情況進一步調整。

 

四、TSA染料單標測試確定一抗?jié)舛群腿玖洗钆?/span>

 

1）組織自發(fā)熒光（Autofluorescence, AF）的檢測：在進行免疫熒光染色之前，需要評估樣本的自發(fā)熒光。自發(fā)熒光是樣本在沒有染色的情況下，由于組織內(nèi)固有的熒光物質在特定波長照射下發(fā)出的光。使用光譜成像系統(tǒng)記錄組織自發(fā)熒光的光譜特性，以便在后續(xù)實驗中避免自發(fā)熒光與目標信號的重疊。即在為靶蛋白選擇熒光染料時，應選擇那些激發(fā)波長與組織自發(fā)熒光波長不同的染料，以減少自發(fā)熒光對實驗結果的干擾。

 

2）使用TSA技術對單個靶標蛋白進行染色。在多重免疫熒光成像（如使用多光譜成像系統(tǒng)）中，記錄每個靶標的熒光信號的曝光強度。根據(jù)記錄的曝光強度和熒光信號，評估染色結果是否滿足以下標準，①特異性：熒光信號應僅在目標蛋白處出現(xiàn)，陰性對照區(qū)域不應有非特異性信號。②曝光時間：良好的信號曝光時間應控制在50-200毫秒，以保證信號的清晰度和對比度。③曝光時間均衡：不同熒光通道的曝光時間應盡量均衡，相差不超過10倍，以保證圖像的一致性。④同一激發(fā)通道的靶標：如果多個靶標使用相同的激發(fā)波長，它們的曝光時間應相近，以確保信號的可比性。

 

3）TSA單標染色使用的一抗稀釋度需要根據(jù)IHC染色驗證的DAB顯色時間確定：如DAB顯色時間為20-30sec，則將IHC驗證好的一抗稀釋度進一步稀釋2倍；如DAB顯色時間為40sec-1min，則將一抗稀釋度進一步稀釋1倍。

 

五、實驗流程

 

 

需要在前3個階段均取得滿意的結果之后，才可以進行多重熒光免疫組化染色。正式實驗以前，選擇1-2個小樣本進行小量mIHC預實驗，明確靶蛋白的染色順序，確定好后開展正式實驗，注意不要隨意更改TSA染料單標染色已經(jīng)驗證好的實驗條件：如一抗稀釋度和孵育條件、抗原修復液類型和修復條件、二抗試劑種類和孵育條件。

 

1、切片、烤片及烘片

 

1）切片：使用粘附載玻片，腸癌組織切片厚度為5μm。若是組織芯片，需準備與組織芯片組織類型相對應的常規(guī)組織切片進行預實驗條件摸索。

 

2）烤片：切片后立刻烤片，先60℃烤6-8小時，再40℃過夜保存，避免光照。切片后一個月內(nèi)使用。這一步能避免組織在處理過程中脫落。

 

3）實驗前烘片：實驗前，將石蠟切片60℃烘片1小時。提高組織與載玻片的粘附力，防止在染色過程中脫落。

 

2. 脫蠟水合

 

1) 二甲苯脫蠟：新鮮二甲苯浸片10min，重復3次;或浸片30min，重復2次。去除切片中的石蠟，因為石蠟會阻礙抗體與抗原結合。

 

2)梯度乙醇浸片:100% 5min，重復2次;95% 5min;90% 5min;80% 5min。(3)滅菌水洗片1min,重復3次。這有助于溫和地將組織從有機溶劑中過渡到水環(huán)境中，避免細胞和組織結構受損。

 

3. 后固定

 

10%中性福爾馬林浸片10min，滅菌水洗片1min，重復3次。固定組織樣本，保持細胞和組織結構的完整性，避免在處理過程中發(fā)生變性或破壞。

 

4. 封閉內(nèi)源性過氧化氫酶(可選用)

 

1)新鮮配制 3%H2O2:20ml H2O2 (30%)+180ml milipore H2O。

 

2) 3%H2O2浸片15 min。

 

3) 水洗,3次,每次1min。

 

封閉組織中的內(nèi)源性過氧化氫酶，防止它們在顯色反應中產(chǎn)生背景染色，提高特異性。

 

5. 微波修復抗原

 

1)抗原修復液放入修復杯后置于微波爐內(nèi)高火5min，至煮沸。

 

2)將脫蠟水合后的玻片置于預煮沸的抗原修復液中,保證片子全部浸沒于抗原修復液。

 

3)低火維持15min(注意補液，防止蒸發(fā)過度導致干片)。

 

4) 取出放入冰水水浴中冷卻至室溫。

 

開放蛋白質的抗原表位，使抗體更容易與目標抗原結合，提高染色效果。

 

6. 封閉

 

1) 去除玻片上殘存洗液。

 

2)用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加封閉液，覆蓋樣本區(qū)域。

 

3) 室溫保濕振蕩10min。

 

避免抗體在非目標區(qū)域非特異性結合，從而減少背景染色。

 

7.一抗孵育

 

1) 去除玻片上的封閉液。

 

2)用移液器滴加稀釋的一抗溶液，浸沒樣本區(qū)域。

 

3)室溫或37℃保濕振蕩孵育1-2h(需針對不同抗體做優(yōu)化調整)。

 

4)用1×TBST buffer浸洗玻片3min,重復3次。

 

8. 二抗孵育

 

1)去除玻片上殘存的洗液。

 

2)直接滴加HRP標記的二抗工作液，浸沒樣本區(qū)域。

 

3) 室溫保濕孵育10min。

 

4)用1×TBST buffer 浸洗玻片 3min，重復3次。

 

9.熒光染色放大信號

 

1) 去除玻片上殘存的洗液。

 

2)滴加1×TSA 染料工作液100μL(用信號放大反應液按1:100稀釋)，浸沒樣本區(qū)域。信號放大，提高熒光信號的強度，使目標蛋白更易于檢測。

 

3)室溫保濕振蕩孵育10min。

 

4) 1×TBST buffer 室溫浸洗玻片3min，重復3次。

 

5) 微波修復洗脫，室溫自然冷卻至室溫。

 

6) 滅菌水洗片1次，1×TBST buffer洗2min。

 

10.本輪染色結束，追加后續(xù)染色，重復第6步到第9步。

 

11.封片

 

1) 去除玻片上殘存洗液，滴加DAPI工作液，室溫保濕孵育10min。DAPI染色核酸，通常用于標記細胞核，提供細胞定位的參照。

 

2) 1×TBST buffer 浸洗玻片，室溫3min，重復3次。

 

3）用滅菌水洗片。

 

4) 待玻片微干，用移液器在玻片上滴加抗淬滅封片劑，浸沒樣本區(qū)域。

 

5)加蓋玻片，指甲油封片。

 

12.閱片

 

對染色后的組織切片用激光共聚焦熒光顯微鏡或多光譜組織成像系統(tǒng)觀察和成像，并進行結果判讀。

 

六、多重免疫組化結果解讀 

 

 

 

上圖是筆者自己做的多重免疫組化的原圖，下面就對上圖進行解析，

 

在圖像中可以看到以下幾種標記：

 

DAPI：這種染料用來標記細胞核，發(fā)出藍色熒光。在圖中，所有細胞的核都被DAPI染成了藍色，作為細胞定位的基礎。

 

CD4：這是一種標記特定輔助T細胞的抗體，常用于識別免疫系統(tǒng)中的特定活躍細胞。在圖中，CD4+細胞發(fā)出黃色熒光。

 

CD8：標記細胞毒性T細胞的抗體，這種細胞在免疫反應中具有殺傷功能。在圖中，CD8+細胞發(fā)出綠色熒光。

 

CD16：這是標記自然殺傷細胞（NK細胞）的抗體之一。在圖中，CD16+細胞可能發(fā)出紅色熒光。

 

CD68：標記巨噬細胞的抗體，巨噬細胞是吞噬和清除外來微生物和死亡細胞的免疫細胞。CD68+細胞在圖中發(fā)出橙色熒光。

 

FoxP3：這是一種標記調節(jié)性T細胞（Treg）的抗體，這些細胞有助于免疫系統(tǒng)保持自我容忍和防止自身免疫疾病。FoxP3+細胞在圖中發(fā)出紫色熒光。

 

pan-CK（泛細胞角蛋白）：標記上皮細胞的抗體，通常用于識別癌癥中的上皮細胞。在圖中，這些細胞可能呈現(xiàn)出藍色或其他顏色。