間接競爭ELISA是一種基于抗原-抗體特異性結合的免疫檢測技術，用于檢測樣品中微量的小分子抗原或半抗原。

在該實驗中，先將已知抗原包被在酶標板的微孔表面，然后加入待測樣品和一定量的抗體。如果樣品中含有目標小分子（抗原），這些小分子會與包被在板上的抗原競爭有限的抗體結合位點，從而抑制抗體與包被抗原的結合。接著加入酶標二抗，與結合在包被抗原上的抗體結合，通過酶催化底物產生顯色反應，根據顏色的深淺來定量分析樣品中目標小分子的含量。

由于樣品中目標小分子的量與最終的顏色信號成反比，所以通過測量吸光度值可以間接反映出樣品中目標小分子的濃度。 

一、實驗前準備

1、試劑選擇

（1）包被抗原：選擇具有良好免疫原性和特異性的抗原，它將作為固相載體上的捕獲分子，決定著整個實驗的特異性和靈敏度。因此盡量使用高純度的抗原，可通過親和層析、離子交換層析等方法純化。如果是自己制備的抗原，要確保其結構完整，避免變性。例如，對于蛋白類抗原，可使用SDS-PAGE和Western blot來鑒定其純度和分子量。保存抗原時，根據其穩定性選擇合適的保存條件，一般在-20℃或-80℃，避免反復凍融。

（2）抗體是間接競爭ELISA的核心試劑，與抗原的親和力和特異性直接影響實驗結果。因此可以使用單克隆抗體或多克隆抗體。單克隆抗體特異性強，批間差異小；多克隆抗體可能具有更好的親和力，但特異性相對稍弱。選擇時根據實驗要求權衡。保存抗體時，遵循供應商的建議，一般在4℃短期保存或-20℃長期保存，避免反復凍融。可將抗體分裝成小份，使用時取出一份，減少因反復凍融導致的活性下降。

（3）酶標二抗：酶標二抗與一抗結合，通過酶的催化作用產生可檢測的信號。選擇與一抗來源物種相匹配的酶標二抗，如一抗是小鼠來源的，可選擇抗小鼠的酶標二抗。確保二抗的工作濃度經過優化，可通過預實驗確定最佳濃度。購買高質量的酶標二抗，檢查其保質期和保存條件，通常在4℃保存，并注意避免光照，因為一些酶（如HRP）對光敏感。

2、耗材準備

（1）酶標板：作為反應的固相載體，其質量會影響抗原包被效果和實驗背景信號。優先選擇質量可靠的品牌，如Costar、Nunc等。不同類型的酶標板（如聚苯乙烯、聚氯乙烯）可能對實驗結果有影響，一般使用聚苯乙烯的高吸附板進行蛋白包被。在使用前檢查酶標板是否有損壞或污染，可通過肉眼觀察或用蒸餾水清洗后檢測吸光度來判斷。

（2）移液器和吸頭：準確的加樣對于實驗結果的準確性至關重要。使用經過校準的移液器，定期檢查和校準其準確性。使用合適量程的移液器，避免超量程使用。選擇與移液器匹配的高質量吸頭，確保吸頭無RNase、DNase和內毒素，防止污染。 

二、實驗操作

1、包被：將抗原固定在酶標板的孔底，為后續與抗體的結合提供結合位點。一般使用碳酸鹽緩沖液（pH9.6）或PBS緩沖液（pH7.4）作為包被緩沖液，將抗原稀釋至合適濃度（根據預實驗優化，一般為0.5~10μg/mL）。每孔加入100μL抗原溶液，4℃過夜或37℃孵育2~4小時。包被后，用洗滌液（一般是含0.05%Tween-20的PBS）洗滌3~5次，以去除未結合的抗原。可以使用酶標儀檢測OD值，判斷包被效果，一般OD值在0.8~1.2之間較為理想。

2、封閉：封閉未被抗原占據的酶標板表面，減少非特異性吸附。常用的封閉劑有牛血清白蛋白（BSA）、脫脂奶粉等。使用1%~5%BSA或5%脫脂奶粉的PBS溶液，每孔加入200μL，37℃孵育1~2小時或4℃過夜。封閉后徹底洗滌，確保去除未結合的封閉劑，以免影響后續的反應。

3、競爭反應：在樣品和已知濃度的標準品中加入一抗，使它們競爭與包被抗原結合，樣品中的目標分子會與標準品競爭結合抗體，從而反映樣品中目標分子的濃度。準備一系列濃度的標準品溶液，涵蓋預期的樣品濃度范圍。同時加入適量的一抗，一抗濃度根據預實驗優化。一抗孵育時間和溫度可根據抗體說明書和預實驗調整，一般37℃孵育1~2小時或室溫孵育2~4小時。包括陽性對照、陰性對照和樣品孔，每個樣品和標準品設多個復孔，以提高結果的可靠性。

4、酶標二抗孵育：使酶標二抗與一抗結合，為后續顯色反應做準備。使用含0.05%Tween-20的PBS稀釋酶標二抗，稀釋倍數根據預實驗確定，一般為1:5000~1:20000。每孔加入100μL酶標二抗溶液，37℃孵育1小時左右，然后充分洗滌，去除未結合的二抗。

5、顯色和終止原理：通過酶催化底物產生顏色反應，終止反應后測量吸光度，反映目標分子的含量。若使用HRP標記的二抗，常用的顯色劑是TMB底物，加入100μL，在室溫或37℃避光顯色10~30分鐘，至顏色達到一定強度。使用2M硫酸終止反應，每孔加入50μL，終止反應后立即在酶標儀上讀取450nm（或450/630nm雙波長）處的吸光度。

三、實驗數據分析

1、標準曲線繪制原理：根據標準品的濃度和相應的吸光度值繪制標準曲線，用于定量分析樣品中的目標分子濃度。以標準品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，使用軟件（如GraphPadPrism、Excel）繪制標準曲線。通常使用四參數邏輯曲線（4PL）擬合，該曲線能較好地擬合間接競爭ELISA的數據。檢查曲線的擬合度（R²值），一般要求R²>0.95，確保曲線的可靠性。

2、結果分析原理：根據標準曲線計算樣品中目標分子的濃度。將樣品的吸光度值代入標準曲線方程，計算出樣品中目標分子的濃度。對于超出標準曲線范圍的樣品，需要稀釋或濃縮后重新檢測。分析數據時，計算樣品濃度的平均值和標準差，評估實驗的重復性和準確性。對于多組實驗數據，可以使用統計分析軟件（如SPSS）進行組間比較。 

四、常見問題及解決方法

1、高背景信號可能原因及解決方法

（1）封閉不充分：增加封閉劑的濃度或延長封閉時間，優化封閉條件。

（2）洗滌不徹底：增加洗滌次數或延長洗滌時間，確保洗滌液完全覆蓋孔底，避免殘留的試劑影響后續反應。

（3）酶標二抗濃度過高：降低二抗濃度，重新進行實驗。

2、低信號強度或無信號可能原因及解決方法

（1）抗原或抗體失活：檢查試劑的保存條件和有效期，使用新的試劑重新實驗。

（2）包被效果不好：優化包被抗原的濃度和包被條件，如調整包被緩沖液、時間和溫度。

（3）顯色時間過短：適當延長顯色時間，但要避免過度顯色導致顏色過深，難以準確測量。