一、實驗原理

 

通常地，在未受到刺激的細胞中，NF-κB通常與抑制蛋白IκB結合形成復合物，存在于細胞質中。然而，當細胞受到細胞因子（如IL-1β、TNF等）、脂多糖（LPS）等外界刺激時，在經典的NF-κB信號通路中這些刺激信號首先與細胞膜上的相應受體結合最后導致IκB被降解，進而釋放出NF-κB二聚體，自由的NF-κB二聚體由于其C端結構域上的核定位區域暴露，能夠通過核孔復合物進入細胞核。在細胞核內，NF-κB二聚體與有NF-κB結合位點的基因啟動子區域或增強子區域特異性結合，啟動相關基因的轉錄。

 

 

NF-κB是細胞內重要的轉錄因子，其活性受到嚴格調控。通過檢測NF-κB移位入核情況，可深入了解細胞在受到各種刺激（如細胞因子、病原體感染、物理化學因素等）后，NF-κB信號通路的激活機制，包括信號的起始、傳導、放大以及與其他信號通路之間的交互作用。另外，檢測其移位入核有助于確定在不同生理或病理條件下，NF-κB所調控的具體基因靶點，以及這些基因在細胞增殖、分化、凋亡、免疫反應等過程中的作用。 

 

二、實驗步驟

 

（1）細胞培養與刺激

 

準備適合大小的無菌爬片放在12孔板中，可用PBS潤洗孔板使得玻璃爬片更加貼合孔板底部；狀態良好的細胞鋪于12孔板中，37°C、5%CO?培養48h。將細胞培養至80%左右的濃度后，加入適當的刺激劑，如TNF-α或IL-1β，在特定的時間點進行刺激，同時設置未刺激的陰性對照組。

 

（2）處理孔板與固定細胞

 

處理好的孔板，PBS輕輕潤洗細胞2-3次，使用4%多聚甲醛在室溫下固定30min；固定完成后，用PBS洗滌細胞3次，每次約5min，去除固定劑。

 

（3）細胞通透處理

 

PBS稀釋10% TritonX-100至0.2%加入固定的細胞中，室溫下通透孵育15min，使抗體能夠進入細胞內部與抗原結合。隨后，用PBS潤洗3次，每次5min。

 

（4）封閉非特異性結合位點

 

使用5%牛血清白蛋白（BSA）室溫下孵育1h。孵育完成后，用PBS洗滌細胞3次，每次10min。

 

（5）細胞免疫染色

 

用PBS配置5%牛血清白蛋白的稀釋液，稀釋抗-NF-κB抗體并孵育細胞， 4°C下孵育過夜。一抗孵育完成后，用PBS洗滌細胞3次，每次10min。

 

（6）二抗染色

 

用PBS配置5%BSA的稀釋液，按照相應比例稀釋熒光標記的二級抗體孵育細胞，室溫下孵育1h。孵育結束后，用PBS洗滌細胞3次，每次10min。

 

（7）細胞核染色

 

使用熒光染料，如DAPI或Hochecst，將細胞核染色，通常在室溫下孵育15min。然后用PBS洗滌細胞3次，每次約10min。

 

（8）封片與觀察

 

準備好鑷子并配置90%的甘油（丙三醇）進行封片。通常地，一塊載玻片放置2塊爬片，首先在載玻片上滴加20ul90%甘油，用吸水紙吸干爬片上的液體，將細胞爬片倒扣在甘油滴或更換適量的抗熒光淬滅封片液進行封片，并用高亮透明的指甲油在爬片周圍固定爬片。最后用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞免疫熒光。

 

（9）蔡司激光共聚焦顯微鏡（LSM900）的簡單操作步驟

 

1、開機流程：根據標簽1-8的順序開機包括激光、顯微鏡、主機等。雙擊打開藍色ZEN System，等待系統自檢和初始化。

 

標簽[1]：激光器，控制激光；鑰匙控制開啟時由【0】擰到【1】，例如圖1

 

標簽[2、3]：總控制器

 

標簽[4]：載物臺控制器

 

標簽[5、6]:顯微鏡控制器

 

標簽[7]:熒光光源開關

 

標簽[8]：電腦主機

圖1 標簽【1、2、3】

 

圖2 顯微鏡的大致組成（激光、顯微鏡、主機）

 

2、拍攝2D圖像

 

1）在軟件界面中找到Locate按鈕，點擊其中的BF，GFP等快捷鍵(快捷按鈕選擇樣品染料顏色)，切換至人眼觀察模式。在TFT觸摸屏上，找到所選用物鏡，調好焦距。找到焦平面。

 

2）切換至Acquisition，點擊Smart Setup，選擇所用熒光染料。選擇模式，自動匹配光路設置。

 

3）在Channels菜單欄中調節激光強度與Master Gain值。在live預覽模式下使用Range Indicator判定圖像質量。

 

4）當圖像出現藍色背景與即將出現紅色過曝光點時stop并設置Acquisition Mode.選擇合適的像素分辨率掃描速度等。

 

5）點擊Snap按鈕，拍攝并注意保存。

 

3、拍攝Airyscan 超高分辨率圖像

 

1）點擊Smart Setup，選擇需要的染料；點擊Airyscan。

 

2）在Channels菜單欄中調節激光強度與MasterGain值，注意不要過曝:

 

3）在Acquisition Mode選擇最快的掃描速度，不做平均，Zoom不小于1.3x,設置好后點擊Snap拍攝。

 

4）拍攝后進入Processing-Airyscan Processing.5.2D SR Processing-Input-Apply進行圖像處理

 

4、圖像導出

 

可根據需要選擇Processing>lmage Export/MovieExport，對采集的圖像進行導出。

 

5、關機流程

 

（1）將樣品移出，保存數據并關閉軟件。關閉電腦。

 

（2）清潔顯微物鏡，并將其轉到空位或低倍鏡上

 

（3）依照標簽7-1順序，逆序關閉系統。

 

6、圖片分析處理

 

（1）優勢：高分辨率，多通道熒光，圖片拼接以及組織切片層數掃描。

 

（2）圖3是由油鏡 63×拍攝的NF-κB移位入核：

 

圖3 NF-κB移位入核

 

（3）添加比例尺：點擊圖片下方【Graphics】，點擊紅色區域，自動添加比例尺。

 

圖4 添加比例尺

 

三、注意事項

 

1、選擇處于對數生長期、狀態良好的細胞進行實驗，細胞密度最好在70%~80%左右，密度過大或過小都可能影響實驗結果。

 

2、注意要根據一抗的種屬來源選擇相應的二抗，且從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都要避光。

 

3、選擇與目標蛋白高度特異性結合的抗體，并確保一抗和二抗的種屬匹配，避免交叉反應。同時，要根據實驗需求選擇合適熒光標記的抗體。

 

4、在固定與通透的過程中，固定液的選擇取決于被研究抗原的性質及所用抗體的特性，針對磷酸化的抗體，不適合用甲醛。通透劑的濃度和時間也要根據細胞類型和抗原位置進行優化，避免過度通透導致細胞結構破壞。

 

5、封閉液的種類和濃度要選擇合適，封閉時間要足夠，以減少非特異性抗體結合

 

6、一抗和二抗的孵育時間和溫度要根據抗體說明書進行優化，孵育過程中要注意保持樣品的濕潤，避免干燥。同時，要注意控制抗體的濃度，避免過高或過低導致假陽性或假陰性結果。

 

7、根據實驗要求選擇合適的熒光染料，考慮其激發和發射波長，以確保熒光信號可以被檢測設備有效捕捉。同時，要注意熒光染料的穩定性和淬滅問題，從加熒光二抗起，盡量避光操作，封片后應盡早拍攝。

 

8、設置陽性對照組和陰性對照組，以確保實驗結果的準確性和可靠性。陽性對照組可以使用已知能誘導NF-κB入核的刺激劑處理細胞，陰性對照組則不添加任何刺激劑。

 

9、正確使用激光共聚焦顯微鏡，觀察時要注意區分細胞的自發熒光和特異性熒光信號，避免誤判。