導讀

近年來標簽輔助蛋白純化是學術研究和大規模工業需求的首選方法，在蛋白質生產過程中應用純化標簽有助于節省時間和成本，但標記融合蛋白的設計和應用具有挑戰性，適當的標記策略必須保證最終蛋白產品的表達量和高純度，同時保持其天然結構和功能。伊朗研究人員曾在Biotechnology Advances上發表了題目為《Opportunities and challenges of the tag-assisted protein purification techniques: Applications in the pharmaceutical industry》的綜述。詳細介紹了蛋白質和肽結構的純化標簽的分類、選擇及在親和、離子交換、反相和固定化金屬離子親和色譜中的應用。

一、蛋白純化標簽概述

蛋白純化標簽是一種在蛋白表達體系中引入特定序列或結構的標簽，利用這一標簽與其它分離手段的相互作用，實現對目標蛋白的高效純化的技術。標簽可以是一個完整的酶，一個蛋白質結構域或一個小的多肽鏈。它們可以結合一系列底物，如碳水化合物、小生物分子、金屬螯合劑和高特異性抗體，并有助于提高相關對應物的回收率和產量[1]。

二、蛋白質和肽標簽的一般分類

標簽可以添加到目標蛋白的任何一端，因此它們可以是c端特異性的或n端特異性的或c端和n端特異性的。從生物化學角度看，標簽可分為非干擾性標簽和干擾性標簽。

2.1非干擾性標簽

非干擾性標簽如組氨酸標簽His-tag和鈣調蛋白結合肽（Calmodulin-Binding Peptide，CBP）等，純化后不需要去除標簽序列，并且一些非干擾性標簽對重組蛋白的性質和功效有多種積極影響。可以提高生產產量和質量、促進蛋白質正確折疊、防止蛋白水解、抑制融合蛋白的抗原性、改善功能特性及增加目標蛋白的溶解度等。一些基于標簽的系統（如熒光標簽）還可用于跟蹤蛋白質表達和純化過程。

2.2干擾性標簽

干擾性標簽如麥芽糖結合蛋白（Maltose-Binding Protein，MBP）和谷胱甘肽S轉移酶（Glutathione S-Transferase，GST）等，通常較大，會干擾主蛋白的結構和功能，所以純化后必須去除。其缺點包括生物活性改變、蛋白質產量降低、產生毒性、結構靈活性不當、蛋白質聚集或錯誤折疊等。有時可通過特定的蛋白酶系統去除標簽，并且在設計干擾性標簽時，需要在目標蛋白和標簽序列之間設置特定的蛋白酶位點。

三、蛋白純化最佳標簽的選擇

為標簽輔助純化系統引入最佳標簽時應考慮多種因素，包括易于去除、單步純化、對蛋白質結構和功能的影響最小、多功能性和可及性等[2][3]。當標簽在目標蛋白內折疊時，這一過程可能會受阻，因此在為每個實驗選擇合適的標簽時，同時還需考慮其他因素如蛋白質類型、表達系統的性質以及目標蛋白的后續應用[4]。例如His-tag純化系統對二氫葉酸還原酶（Dihydrofolate Reductase，DHFR）的純化比組蛋白乙酰轉移酶（Histone Acetyltransferase，HAT）更有效。

四、標簽輔助色譜法純化蛋白

4.1標簽輔助親和色譜法

親和色譜是生物技術競爭市場中最常用的工具。一組兩種生物分子（如抗原-抗體、激素-受體和酶底物）之間的選擇性和特異性相互作用是親和系統設計的基礎。在每一個親和體系中，這對分子中的任何一個都固定在固體載體（主要由瓊脂糖或二氧化硅基質組成）上，形成親和配體，在通過色譜柱時幫助捕獲對應的配體。最后在徹底清洗不可保留的成分后，使用合適的洗脫緩沖液從色譜柱中回收有價值的親和配體。根據參與親和相互作用的配體的性質，親和系統可分為四大類：免疫親和（基于抗原抗體或表位抗體相互作用）；特定配體生物親和性（基于酶與其相應的特定底物、抑制劑或輔助因子的相互作用，以及特定的激素受體相互作用）；一般配體生物親和性（基于某些生物分子對一組配體的一般親和性）及適配體親和層析（Aptamer Affinity Chromatography，AAC）。

圖1 標簽輔助的一般配體生物親和性和特定配體生物親和性純化

4.2標簽輔助固定化金屬離子親和色譜法

固定化金屬離子親和層析（Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC）系統是基于一些蛋白質和肽序列對金屬離子的親和性。這些蛋白質和肽序列必須包含能與金屬離子形成強配位共價鍵的電子供體原子（如在組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和絲氨酸中發現的氮、硫或氧），金屬離子使用螯合連接劑固定在色譜樹脂上，螯合連接劑可能針對某些類別的金屬離子。螯合連接劑和金屬離子都將決定色譜柱對蛋白質和肽序列的選擇性。例如，Ni2+、Co2+和Cu2+柱更適合吸附富含組氨酸的序列，而Fe3+和Zn2+柱更適合吸附磷酸化蛋白。設計含有電子給體原子殘基的標記序列可以促進IMAC在蛋白質純化中的應用。組氨酸標簽His-tag是最常用的標簽之一，可用于多種蛋白質的分離，包括重組蛋白和抗體，具有小且非干擾性等優點。6個poly-His標簽序列被認為是最常見的融合標簽，在60%以上的晶體學研究中作為載體驅動標簽被廣泛使用。它還可以在免疫親和層析中用作表位標簽。還有基于其他蛋白質改造的具有金屬結合特性的標簽。

圖2 固定化離子親和層析（IMAC）

4.3標簽輔助離子交換色譜法

蛋白質和多肽可能含有多種可滴定殘基，在給定的pH下，它們的電離狀態將決定它們的電荷，從而決定它們所參與的序列的凈電荷。通過調節溶液的pH值和/或離子強度，可以很容易地調節蛋白質和肽的凈電荷，這使它們成為離子交換色譜（Ion Exchange Chromatography，IEC）柱分離的絕佳選擇。IECs中的固定相由固體樹脂組成，固體樹脂與離子交換基團共價鍵合。這些離子交換基團既可以是正電荷（陰離子交換劑）也可以是負電荷（陽離子交換劑）。磺酸和羧酸是陽離子交換劑的典型代表，叔銨和季銨陽離子是陰離子交換劑的經典代表。根據肽和蛋白質序列的凈電荷，在給定的pH值下，它們可以被靜電吸附到離子或陽離子交換器上，并通過IEC柱分離。與其他色譜方法相比，IEC更便宜，耐受性更強，但特異性較差。因此目前在不斷努力提高IEC的選擇性，特別是在生物醫學應用方面。設計一個足夠帶電的標簽，可以連接到目標蛋白而不干擾其天然結構，是基于IEC的蛋白純化方案的決定性策略。理想的標簽序列將在其靶蛋白和離子交換劑之間提供更強的吸附，這意味著更有效的標簽系統需要更嚴格的洗滌條件。

圖3 離子交換色譜示意圖

4.4標簽輔助反向色譜法

在反向色譜（Reversed Phase Chromatography，RPC）中分子根據其疏水性和吸附在疏水固定相上的傾向進行分離。制備RPC疏水樹脂的常用策略是將不同鏈長的碳氫化合物固定在固定相上，得到一系列反相吸附劑（如C4、C8或C18柱）。樣本在極性溶劑中加載，疏水組分吸附在疏水性樹脂上（熱力學有利的方式），然后用極性逐漸降低的洗脫緩沖液回收，RPC可用于分離非常相似的蛋白質和肽。與其他色譜技術相比，RPC更具經濟性和非破壞性。盡管在折疊過程中，大多數疏水殘基傾向于埋藏在蛋白質結構內部，但那些留在表面的殘基將成為蛋白質參與的許多選擇性疏水相互作用的關鍵參與者（例如膜運輸，幾種酶活性等）。常用的標簽包括多聚苯丙氨酸、多聚異亮氨酸和多聚酪氨酸等，其中最常見的是色氨酸基序列。一些特殊的標簽設計如C9R是一種用于提高煙草蝕紋病毒（Tobacco Etch Virus，TEV）蛋白酶溶解性和表達產量的標簽。

圖4 反向色譜示意圖

結語

由于生物信息學的最新進展和高通量技術的出現，許多新的標簽被引入市場，各種干擾和非干擾標簽已經超出了作為簡單的凈化工具的傳統用途，拓寬了其應用范圍。目前在簡化蛋白質生產過程方面已經取得了很大進步，但是在設計和/或選擇適合特定應用的標簽時仍然需要考慮多種因素，并且在標簽技術的成熟方面還有待取得更大進展。

參考文獻

[1] Yeonju Lee, Kyung-Min Kim, et al (2023). Cyclized proteins with tags as permeable and stable cargos for delivery into cells and liposomes. International Journal of Biological Macromolecules.252.

[2] Kinrade, B., Davies, et al (2020). Bacterial sugar-binding protein as a one-step affinity purification tag on dextran-containing resins. Protein Expr. Purif. 168, 105564.

[3] Zhao, F., Song, et al (2020). Purification and immobilization of α-amylase in one step by gram-positive enhancer matrix (GEM) particles from the soluble protein and the inclusion body. Appl. Microbiol. Biotechnol. 104 (2), 643–652.

[4] Xinyi Wang, Xinxin Feng, et al (2023).Promoting soluble expression of hybrid mussel foot proteins by SUMO-TrxA tags for production of mussel glue.International Journal of Biological Macromolecules. 225, 840-847.