摘 要： 基于高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）獲得的色譜-光譜數據，建立了一種二元完全重疊液相色譜峰的快速解析定量方法：將HPLC-DAD采集的時間t、波長λ、吸光度S的三維光譜色譜數據，光譜經過背景補償加Savitzky-Golay平滑預處理，得到光譜波長方向的吸光度強度處理值隨時間變化的光譜圖，與對照品光譜計算光譜相似度，實現重疊峰的快速智能化識別；利用導數光譜色譜圖法對預處理的色譜-光譜矩陣進行解析，獲得原點波長，再利用二維相關光譜技術提取特征光譜后，得到基于特征光譜的原點波長的色譜流出曲線，進而得到分離后的色譜峰，實現重疊色譜峰的定量測定。該方法充分利用HPLC-DAD獲得的三維色譜-光譜數據信息，能夠將二元完全重疊色譜峰有效解析分離和定量測定，明顯提高解析結果的準確度，并利用色譜工作站實現了數據采集、解析識別、定量分析一體化智能分析，方法簡單高效。

關鍵詞： 二維相關譜技術； 導數光譜色譜圖法； 高效液相色譜-二極管陣列檢測器； 化妝品； 重疊峰； 識別； 解混

 

高效液相色譜法-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)聯用技術作為復雜組分分離和定量分析的手段之一，具有分析速度快、分離效率高、樣品用量少等優勢[1]，通過成功的色譜分離，實現混合物中各物質的定性和定量分析[2]。多數色譜工作站采集的是時間、波長、吸光度強度三維數據而獲得三維色譜-光譜圖，但是隨著樣本復雜程度的提高，往往會有重疊峰的出現，事實上，實際色譜圖中絕大多數色譜峰都為重疊峰，重疊峰的紫外吸收光譜不利于對結構確證和色譜峰的識別，而色譜峰用于定量計算主要是獲得每個單峰的面積，因此重疊峰的分離是方法開發的一個難題[3]。重疊峰的分離多采用優化色譜條件的方法，但方法優化費時費力，對于多組分復雜基質的分離效果也不盡如人意；隨著化學計量學的發展，將三維色譜光譜信息，按一定的數學模型處理，能解決重疊峰的識別和定量難題，目前常用的重疊峰解析方法包括模式識別[4]、曲線擬合[2,5-6]、小波轉化法[7?8]、因子分析[9]、正交投影[10]等方法，然而上述方法多為光譜解析方法，即在一維水平上進行解析，存在解析結果準確性和可靠性不高的問題，解析結果易受色譜峰重疊度的影響；且利用色譜工作站數據分析系統的化學計量學解析分離算法報道較少。

二維相關譜技術(2D-COS)[11]是將傳統光譜信號擴展到三維平面上，光譜圖具有兩個獨立的變量和一個表示體系光譜學性質的因變量，從而形成三維立體數據，通過研究體系光譜學性質隨兩個變量(特定外擾)變化的情況以及兩個變量的相關性，可提供研究體系中不同組分官能團吸收峰之間的相關信息，可有效地對弱峰、覆蓋峰、偏移峰進行解析，具有較高的光譜分辨率；而且可以通過同步和異步譜交叉峰正負或有無明確各分子官能團振動變化先后順序，可以分析信息來源，提高光譜的解釋能力，實現對化合物結構的解析；二維相關譜技術表征的是隨特定外擾變化的信息，消除了強背景信號對待測組分弱信號的干擾，有助于提取復雜體系中隨外擾變化微弱的特征信息。加上外擾選擇方式的多樣性，如溫度、時間、濃度、激發波長、偏振角、pH等；探針的多樣性，包括紅外光譜、拉曼光譜、熒光光譜、NMR、X射線等，因此，相對于傳統一維光譜，二維相關譜技術具有高選擇性、高分辨率、高圖譜解析能力，是一種強大靈活的光譜技術。正是由于二維相關譜的上述優勢，自廣義二維相關譜理論提出以后，該技術就被廣泛應用于物理、化學[12]、材料[13]、食品[14]、環境[15]等領域。

導數光譜色譜圖法(i-PDeA)是對由二極管陣列檢測器(DAD)得到的數據，將光譜波長方向的導數值隨時間變化轉化為色譜圖的方法。它的基本原理是通過對色譜-光譜數據進行數學導數運算，從而增強和突出樣品中的特定信息，由于導數光譜值遵從朗伯-比耳定律，且具有加和性，以便更容易識別和定量分析化合物。i-PDeA具有峰增強、噪聲減小、無需基線校正、提供結構特征等優勢，特別適用于復雜或重疊的光譜解析。它在化學、生物化學、環境科學等領域中都有廣泛的應用[16]。

依據《化妝品安全技術規范》(2015年版)7.2節對苯二胺等32種組分的檢測方法，使用HPLC-DAD同時分析染發劑中的32種染料成分時，共有3個色譜系統，第1個色譜系統分離包括對氨基苯酚等16個組分，第2個色譜系統分離包括2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽等10個組分，第3個色譜系統分離其余8個組分。當待測樣品中同時含有對氨基苯酚和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽時，在第2個色譜系統下，對氨基苯酚的色譜峰會對2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽的色譜峰產生干擾，形成完全重疊峰，無法準確測定2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽的含量，如果通過調節色譜條件實現干擾色譜峰的完全分離，分離過程不僅費時費力，且會影響組內其他10個色譜峰的分離，達不到預期效果。

筆者以化妝品中染發劑對苯二胺和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽為例，采用二維相關譜技術，以濃度為外擾，構建其分析體系的同步和異步二維相關光譜，根據同步譜中交叉峰的正負和異步譜中交叉峰的有無提取特征光譜波長，并對色譜-光譜數據進行數學一階導數運算，分別提取特征原點波長λx和λy通道的導數光譜色譜圖，得到將混合組分分離后的導數光譜色譜圖，實現在色譜分析軟件上自動化的色譜解析分離以及兩種完全重疊組分的定性和定量分析，實現數據采集、預處理、光譜色譜解析一體化自動分析。該研究不僅為化妝品中安全風險物質HPLC-DAD色譜-光譜庫的建立提供試驗基礎，也為復雜體系中多組分的重疊峰同時分析提供一種可行性方法，并實現了利用色譜分析軟件進行數據采集、解析識別、定量分析一體化智能分析，簡化了數據處理方法，提高了檢測效率。

 

1、 實驗部分

 

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：30A型，包括SPD-30A二極管陣列檢測器(DAD)和LCsolution色譜工作站，日本島津公司。

超聲波清洗器：Wiggens UA22MFD型，德國瓦里根公司。

高速離心機：Thermo ST16型，美國賽默飛世爾科技公司。

數據統計分析軟件：Origin2021軟件、SPSS數據統計軟件。

甲醇、乙腈：均為色譜純，美國賽默飛世爾科技公司。

超純水儀：Milli-Q型，美國密理博公司。

對氨基苯酚對照品：質量分數為98.59%，批號為G979983，德國Dr Ehrenstorfer公司。

2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽對照品：質量分數為99.9%，批號為FS1618266，天津阿爾塔公司。

11批次染發劑樣品：來自2022年國家化妝品監督抽檢的染發劑樣品。

實驗用水由超純水儀制備。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：SUPELCO Discovery RP-AMIDE C16保護柱(50 mm×4.6 mm，5 μm，美國色譜科公司)和Discovery RP-AMIDE C16分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國色譜科公司)；流動相：A相為磷酸鹽混合溶液[稱取十二水合磷酸氫二鈉1.8 g、磷酸二氫鉀2.8 g和庚烷磺酸鈉(C7H15SO3Na)1.0 g，用水稀釋至1 L，混勻，制成含庚烷磺酸鈉(1 g/L)的磷酸鹽緩沖液，用磷酸溶液(10%)調節pH至6.0]，B相為甲醇；洗脫方式：等度洗脫，A相∶B相=90∶10(體積比)；流量：1.0 mL/min；檢測波長：190～400 nm；柱溫：25 ℃，進樣體積：5 μL。

1.3 實驗步驟

1.3.1 樣品預處理

稱取樣品0.5 g (精確到0.001 g)于10 mL具塞比色管中，加入50 %乙醇水溶液至10 mL標線，渦旋1 min，冰浴超聲提取15 min，在0 ℃下以10 000 r/min離心5 min，取上清液經0.45 µm微孔濾膜過濾，濾液作為樣品溶液，并盡快測定。

1.3.2 標準工作溶液的配制

精密稱取對氨基苯酚和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽對照品約50 mg，置于10 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至標線，配制成質量濃度為500 mg/L的混合標準溶液；取混合標準溶液適量，用無水乙醇稀釋，配制成質量濃度分別為5、10、25、50、100、250、500 mg/L的混合標準工作溶液。臨用現配。

1.3.3 數據的獲得

在1.2節儀器工作條件下分別測定對氨基苯酚（以下簡稱成分x）和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽（以下簡稱成分y）的標準工作溶液和樣品溶液，分別獲得對氨基苯酚和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽對照品溶液的三維譜圖數據以及二者混合對照溶液的完全重疊峰的譜圖數據，圖1為成分x和成分y混合對照品溶液、成分x和成分y對照品的三維色譜-光譜圖。

圖1   三維色譜-光譜圖

Fig. 1   Three-dimensional graphs of the peaks

 

 

2、 結果與討論

 

 

2.1 數據預處理

光譜分析中常用預處理方法一般為背景補償、Savitzky-Golay卷積平滑、一階/二階導數校正(1stDer/2stDer)、標準正態變換(SNV)、最大最小歸一化、光譜數據中心化等。背景補償和S-G卷積平滑可以減小儀器噪聲對光譜的影響，提高信噪比，而不改變光譜形狀和寬度；導數校正可以消除基線漂移、提高光譜分辨率[16]。

利用LCsolution色譜工作站處理數據，選擇成分x和成分y對照品溶液采集的吸收光譜，或者選擇成分x和成分y混合對照品溶液采集的重疊色譜峰中僅存在成分x和y的保留時間處，將色譜峰斜率上升時的光譜視為成分x的吸收光譜，斜率下降時的光譜視為y的吸收光譜，對其吸收光譜進行背景補償加Savitzky-Golay平滑預處理，去除噪音和背景干擾、降低基線漂移的影響，但是不改變光譜形狀和寬度。將預處理后的標準化光譜與對照品的標準化光譜庫(自建數據庫)比較，進行庫搜索，計算相似度，進行色譜峰識別。

圖2為成分x和成分y的對照品的標準化光譜圖以及其解析分離后的標準化光譜圖，由解析分離后的標準化光譜圖與對照品的標準化光譜計算相似度，成分x相似度為0.998 220，成分y的相似度為0.998 267，均大于相似度閾值0.99。實驗結果表明重疊峰經過解析分離后，可以實現色譜峰的快速智能化識別。

圖2   光譜圖

Fig. 2   Spectrum of the peaks

2.2 特征波長的提取

將不同濃度待測物系列對照品溶液，按照1.3.1采集其隨濃度變化的二維動HPLC-DAD色譜-光譜數據。根據Noda理論[17]及選擇濃度為外擾，并將采集的混合染發劑體系隨外擾變化的一維動態光譜矩陣A(m×n)，基于式(1)和式(2)進行相關計算，分別得到混合染發劑體系隨外擾變化的同步和異步二維相關譜矩陣Φ（ν1,ν2）和Ψ（ν1,ν2）：

 

(1)

 

(2)

式中：m——動態光譜數；

n——光譜變量數；

T——表示轉置；

N——Hilbert-Noda矩陣。

 

(3)

式中：Njk——Hilbert-Noda矩陣第j行和第k列的值。

根據同步譜中交叉峰的正負和異步譜中交叉峰的有無提取特征光譜波長，見圖3。同步圖3(a)中包括自相關峰和交叉峰，對角線上的峰為自相關峰，對角線外的為交叉峰。對于對氨基苯酚同步二維相關譜，在主對角線197、230 nm處存在自相關峰，表明此波長處的紫外吸收峰強度隨外擾的變化而變化，在主對角線外側(197，230)、(197，295) nm處存在正交叉峰，表明3個紫外吸收峰強度隨外擾變化方向相同，其可能來自同一組分。對于2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽同步二維相關譜[見圖4(a)]，在主對角線207 nm處存在自相關峰，表明此波長處的紫外吸收峰強度隨外擾的變化而變化。在主對角線外側(206，299) nm處存在正交叉峰，表明3個紫外吸收峰強度隨外擾變化方向相同，其可能來自同一組分，且為其特征吸收峰。同步和異步二維相關譜計算結果表明197、230、295和206、299 nm處紫外吸收峰分別為對氨基苯酚和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽的特征波長。

圖3   對氨基苯酚二維相關光譜

Fig. 3   Two dimensional correlation spectrum of p-aminophenol

圖4   2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽相關光譜

Fig. 4   Two dimensional correlation spectrum of 2，4-diaminophenoxyethanolamine hydrochloride

2.3 原點波長的確定

導數光譜色譜圖法(i-PDeA)[16]是將某波長光譜的導數值隨時間變化轉化為色譜圖的方法，DAD將通過檢測池的透射光經全息光柵色散后形成多色光，同時檢測多波長下的吸收可得到采集時間內的色譜-光譜三維圖，如果將時間t、波長λ的三維色譜光譜設為S(t，λ)，則波長λd的導數光譜-色譜表示為：

 

(4)

圖5(a)是兩種成分(目標成分x和y)的吸收光譜，圖5(b)是對吸收光譜沿波長方向求導后的導數光譜。將圖5中成分x的導數光譜內導數為0的波長設為λx，成分y的導數光譜內導數為0的波長設為λy。波長λx的導數光譜色譜圖顯示僅含成分y的洗脫曲線、波長λy的導數光譜色譜圖顯示僅含成分x的洗脫曲線，也就是說可利用波長λx的導數光譜色譜圖僅分離y成分，同時可利用波長λy的導數光譜色譜圖僅分離x成分。因為為負值，導致導數光譜色譜圖的峰值為負，所以需進行正負反轉。

圖5   成分x和y的光譜和導數光譜

Fig.5   Spectra and derivative spectra of components x and y

將采集時間內的時間t，波長λ的三維色譜光譜設為S(t，λ)三維數據，經過2.1的光譜預處理，對吸收光譜沿波長方向求導后得到導數光譜，以成分x導數光譜值為0的波長創建原點波長，所以波長λx的導數光譜色譜圖顯示僅含成分y的洗脫曲線、波長λy的導數光譜色譜圖顯示僅含成分x的洗脫曲線，也就是說可利用波長λx的導數光譜色譜圖僅分離y成分，同時可利用波長λy的導數光譜色譜圖僅分離x成分。因為在波長λy處成分x的導數光譜為負值，導致導數光譜色譜圖的峰值為負，所以需進行正負反轉。可獲得已去除該成分的色譜圖，同法創建成分y的原點波長，求取各導數光譜的原點波長，一階導數的原點檢測結果見表1。當存在多個原點波長時，選擇成分x和成分y的特征波長，且另一成分的強度絕對值大的波長，將成分x的導數光譜值的特征波長且是原點波長設為λx，成分y的導數光譜值的特征波長且是原點波長設為λy，實驗結果表明，成分x的原點波長為λx=196.59 nm，成分y的原點波長為λy=206.17 nm。

表1   一階導數的原點檢測結果

Tab. 1   Results of origin detection of first-order derivatives

 

2.4 流出曲線的擬合

求取成分x的導數光譜在波長λx=196.59 nm的吸收強度值±Py和成分y的導數光譜在波長λy=206.17 nm的吸收強度值±Px，分別提取特征原點波長λx和λy通道的導數色譜圖，得到將x和y分離后的導數色譜圖(見圖6)，利用導數色譜圖，可以得到各成分分離后的色譜圖，系列混合對照品溶液的色譜數據同法處理，利用峰面積繪制標準曲線進行定量分析。

  a—樣品中成分x和y的重疊色譜峰；b—經過解析分離后成分x的色譜峰；c—經過解析分離后成分y的色譜峰圖6　實際樣品重疊色譜峰解析

Fig. 6   Analysis of overlapping chromatographic peaks in actual samples

2.5 線性關系、檢出限與定量限

應用該方法對染發劑中常見的對氨基苯酚和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽的重疊峰進行解析，然后計算解析得到的光譜和對照品的相似度，均大于相似度閾值0.99，說明由分離重疊峰得到的光譜與對照品的光譜無明顯差異。在1.2色譜條件下，對對氨基苯酚和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽的重疊峰進行解析分離，分別提取色譜流出曲線，利用色譜峰峰面積(I)和對應質量濃度(ρ)進行一元線性回歸，計算得到成分x和成分y的線性方程、相關系數，測定11批樣品成分x和成分y的含量，以提取色譜峰信噪比為3對應的樣品中的質量分數作為方法檢出限，信噪比為10對應的樣品中質量分數作為方法定量限。成分x和成分y的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限結果見表2。由表2可知，成分x和y的線性相關系數分別為0.997、0.999 9，方法檢出限分別為0.026、0.032 μg/kg，定量限分別為0.08、0.1 μg/kg。

表2   成分x和y的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限

Tab. 2   Linear ranges，linear equations，correlation coefficients，detection limits and quantitation limits for components x and y

 

2.6 對比試驗

通過優化色譜條件分離兩種混合物，利用色譜峰峰面積和對應質量濃度進行一元線性回歸測定其含量，比較解析分離和色譜分離兩種方法計算兩種成分的含量，結果見表3，并對結果進行Wilcoxon符號秩檢驗統計，統計結果見表4。由表4可知，檢驗統計量Z=-0.616，對應的概率值P=0.538，顯著性水平α為0.05，由于P=0.538＞0.05，因此接受零假設，認為兩種方法的測定結果無顯著性差異，即經過解析分離后與色譜分離后的測定結果無顯著性差異。從光譜的相似性和含量測定的比較結果可知，對氨基苯酚和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽的重疊峰得到了有效分離解析和定量測定。

表3   11批實際樣品解析結果

Tab. 3   Analysis results of 11 batch actual samples

 

注：＜0.01%是能檢出但低于定量限；DE是檢出；ND是未檢出

 

表4   Wilcoxon符號秩檢驗

Tab. 4   Wilcoxon test statistics

注：1）——基于負號的秩和統計量

 

3、 結語

 

探討了基于HPLC-DAD的完全重疊峰的分離解析方法。在對峰的整體純度進行評價以后，尋找光譜穩定區域，對得到的三維譜圖進行背景補償和Savitzky-Golay平滑處理；利用二維相關光譜技術(2D-COS)提取特征光譜，利用導數光譜色譜圖法(i-PDeA)提取特征原點波長，提取被測組分在特征光譜原點波長處的色譜圖，對色譜峰積分實現對完全重疊色譜峰的分離解析并定量測定。將該法用于測定染發劑中的對苯二胺和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽完全重疊峰的解析定量分析，將解析結果和對照品的預處理光譜進行比較，光譜圖相似度大于0.99，實現色譜峰自動識別；利用解析分離后的色譜峰測定其含量，與色譜分離后測定結果進行比較無顯著性差異，得了滿意的結果。結果表明，所建立的方法能夠有效分離HPLC-DAD采集的光譜具有明顯差異的完全重疊色譜峰，實現對復雜體系多組分完全重疊色譜峰的識別和定量測定，并實現了利用色譜工作站進行數據采集、解析識別、定量分析一體化智能分析，簡化了數據處理方法，提高了檢測效率和準確性，該研究不僅為化妝品中安全風險物質HPLC-DAD色譜-光譜庫的建立提供試驗基礎，并對多組分復雜基質的紅外光譜、拉曼光譜、紫外-可見光譜等光譜解析提供思路。

 

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