依據(jù)ICH Q3A指導(dǎo)原則，藥物中的雜質(zhì)可以分為有機(jī)雜質(zhì)、無機(jī)雜質(zhì)和殘留溶劑，可見殘留溶劑是藥物雜質(zhì)控制的重要組成之一。

根據(jù)定義，殘留溶劑是指在原料藥、賦形劑或制劑工藝中使用或產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)試劑。近年來，殘留溶劑的毒性或?qū)Νh(huán)境的危害性越來越引起醫(yī)藥行業(yè)的關(guān)注，對殘留溶劑控制的相關(guān)指導(dǎo)原則也越來越完善。起初，1990年美國藥典僅列出了6種需要控制的殘留溶劑的限度，自1995年起我國藥典開始在附錄中收載“有機(jī)殘留量檢查”，也只列出了7種有機(jī)溶劑，直到1997年ICH Q3C問世，收載69種在藥物中應(yīng)控制的殘留溶劑，2005年起我國藥典殘留溶劑相關(guān)通則與ICH Q3C達(dá)成一致。從此，殘留溶劑分為4類，第一類溶劑是具有致癌性或?qū)Νh(huán)境有嚴(yán)重危害的溶劑，應(yīng)避免使用；第二類溶劑是可能引起畸變或神經(jīng)毒性等不可逆毒性、或其他嚴(yán)重但可逆毒性的溶劑，應(yīng)限制使用；第三類溶劑是藥物中以一般量（≤0.5%）存在時認(rèn)為對人體無害；第四類溶劑是尚無足夠安全性數(shù)據(jù)的溶劑，這類溶劑的控制限度需根據(jù)文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫提供的毒理學(xué)研究數(shù)據(jù)來確定。

對于殘留溶劑的檢測方法，眾所周知是采用氣相色譜法。那么氣相色譜方法開發(fā)流程是怎樣的，有哪些經(jīng)驗和技巧呢？

開發(fā)流程：

第一步：全面分析待檢測藥物合成路線（包括起始物料的合成路線）中使用的有機(jī)試劑，除直接使用的有機(jī)溶劑外還要分析合成過程中可能會生成的有機(jī)溶劑，這一步要盡量羅列全面，不要漏掉任何一個試劑。例如下圖中有機(jī)試劑A至J都是需要控制的殘留溶劑。

某原料藥合成路線簡圖

第二步：查閱待測溶劑的沸點、極性和控制限度，大多數(shù)常規(guī)溶劑的限度可以在中國藥典2020年版四部指導(dǎo)原則0861殘留溶劑測定法或ICH Q3C殘留溶劑指南中查到，如果所使用的試劑在藥典或ICH指導(dǎo)原則中沒有明確的限度，則需要查閱相關(guān)文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站，依據(jù)毒理試驗數(shù)據(jù)合理制定其控制限度。

第三步：檢測器類型選擇，通常FID檢測器可以適用于大多數(shù)溶劑的檢測，當(dāng)待測溶劑含有強(qiáng)電負(fù)性時（如二氯甲烷），也可以選擇ECD檢測器。

第四步：溶樣溶劑選擇，溶樣溶劑應(yīng)選擇純度高（干擾峰少）、對供試品溶解性好、本身沸點略高于待測溶劑的溶劑，不推薦用水做溶樣溶劑，因為水會縮短色譜柱使用壽命。最常用的溶樣溶劑包括N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）、N-甲基吡咯烷酮（NMP）、N,N-二甲基乙酰胺（DMA）等，在溶樣溶劑篩選時很難預(yù)測哪個溶劑更適宜，需要逐個進(jìn)樣后依據(jù)結(jié)果來篩選。

第五步：進(jìn)樣方式選擇，氣相色譜進(jìn)樣方式包括頂空進(jìn)樣和直接進(jìn)樣，自頂空進(jìn)樣問世以來，因其對色譜柱和檢測器污染較少已成為主流，因此我們在方法開發(fā)時首選頂空進(jìn)樣。

第六步：色譜柱選擇，根據(jù)待測溶劑的極性情況，選擇合適的色譜柱，這也是方法開發(fā)中極其重要的一步，色譜柱填料類型及規(guī)格對待測試劑的分離起著關(guān)鍵作用。氣相色譜柱的選擇有以下四方面內(nèi)容：

（1）填料類型：氣相色譜柱填料可以分為極性、中等極性和弱極性3種。在方法開發(fā)之初，當(dāng)有多種溶劑需要分離時可以首先嘗試涵蓋范圍較廣中等極性色譜柱，然后再分別嘗試極性和弱極性色譜柱，這樣基本就可以實現(xiàn)全覆蓋。

（2）柱長：依據(jù)范氏方程，柱長與分離度成正比。當(dāng)待測有機(jī)溶劑數(shù)量較少，樣品基質(zhì)也沒有明顯干擾時，可以選擇較短的柱長，如30 m，這樣可以縮短分析時間，提高分析效率。當(dāng)所需分析的有機(jī)溶劑數(shù)量多、分離度不佳或者樣品基質(zhì)有很多干擾峰時就需要選擇更長的柱長，如60 m、75m。例如，在某藥物殘留溶劑的分析過程中，起初采用30 m長色譜柱，無論怎樣調(diào)整升溫程序，溶劑A與B之間分離度總是小于1.5，更換60 m色譜柱后，兩者分離度大于2.0，滿足分離要求。

（3）內(nèi)徑：通常情況下，內(nèi)徑越小，柱效越高，峰型越好看，但同時柱壓會相應(yīng)增高，柱容量會有所降低。0.25 mm~0.53 mm是常用的色譜柱內(nèi)徑，內(nèi)徑并不適合越細(xì)越好，當(dāng)各種溶劑分離度都較好時可以選擇稍大的內(nèi)徑，降低系統(tǒng)壓力，當(dāng)溶劑間分離不佳需要更窄的峰型時選擇細(xì)內(nèi)徑。

（4）膜厚：膜厚會影響載樣量、分離度、保留時間。通常溶質(zhì)保留與膜厚度成正比，膜厚度增加可以使溶劑得到更高的保留，改善出峰較早組分的分離，但對出峰較晚組分的分離無改善，甚至?xí)p失分離度。此外增加膜厚，可以增加柱容量，當(dāng)溶劑數(shù)量多、響應(yīng)偏高或進(jìn)樣量較大時盡量選擇厚液膜，否則很容易超載，導(dǎo)致峰型變差。

第六步：載氣流速選擇，載氣流速的選擇相對容易，可按最佳流速來設(shè)置，不同的內(nèi)徑色譜柱對應(yīng)不同的最佳載氣流速范圍，見下表：

通常降低流速可以提高分離度但同時會損失柱效，因此流速的調(diào)整需要在分離度改善程度和峰展寬造成的靈敏度損失之間尋找平衡。

第七步：升溫程序設(shè)置，像高效液相中洗脫梯度一樣，氣相色譜中的升溫程序?qū)Ψ蛛x度有重要影響，在方法開發(fā)之初可以先設(shè)置一個通用簡單的升溫程序，然后再根據(jù)各溶劑的保留情況進(jìn)行調(diào)整。

經(jīng)過上述的一系列操作，我們就基本建立了一個殘留溶劑檢測的初始方法。需要注意的是，方法開發(fā)并不是按著以上操作步驟一次性就能解決的，往往需要在初始方法的基礎(chǔ)上循環(huán)往復(fù)的優(yōu)化各種參數(shù)，以達(dá)到靈敏度、分離度、回收率等各項要求。下面將討論當(dāng)分析方法未達(dá)到目標(biāo)要求時需要怎樣優(yōu)化方法？從哪些流程入手來優(yōu)化。

如何優(yōu)化：

第一、分離度不夠

分離度是方法開發(fā)的硬性指標(biāo)，溶劑間分離度不低于1.5是不可打折扣的要求。溶劑的保留時間及分離是溶劑沸點、極性、色譜柱填料類型以及升溫程序等各種因素的綜合作用的結(jié)果。當(dāng)分離度不佳時可以考慮從以下幾方面進(jìn)行優(yōu)化。

1）更換色譜柱填料類型：填料類型對溶劑的保留有重要影響，更換色譜柱填料類型是改善分離度的最有效的方法，例如在開發(fā)過程中如果在HP-5或DB-1701等色譜柱中總是分離度不適宜，可以考慮更換DB-624色譜柱，可能分離度問題迎刃而解。

2）柱長：當(dāng)在短柱中分離不好，可以更換同種填料的長柱。

3）升溫程序調(diào)整：調(diào)整的方式包括起始柱溫和升溫速率。需根據(jù)各溶劑的保留時間分布進(jìn)行有針對性的調(diào)整，如果第一個溶劑出峰過晚或過早，那么可以先適當(dāng)提高或降低起始柱溫使第一個出峰的溶劑有一個適宜的保留時間，然后在溶劑分布很稀疏的地方可以適當(dāng)加快升溫速率，在溶劑分布很密集、分離度不好的地方，可以適當(dāng)降低升溫速率。

第二、分析靈敏度不夠

一般情況下，我們所開發(fā)的方法的定量限至少應(yīng)低于溶劑限度的3~5倍，這樣更能確保限度濃度的樣品分析的準(zhǔn)確性。對于限度較高的溶劑如乙醇、甲醇、乙酸乙酯等，這個要求很容易達(dá)到，但當(dāng)所分析的溶劑限度很低或是響應(yīng)因子很低時，往往很難達(dá)到所需的靈敏度。以苯為例來說，其限度是0.0002%（2 ppm），定量限需要達(dá)到的濃度應(yīng)為0.00004%~0.00007%（0.4ppm~0.7ppm）之間，這是一個挑戰(zhàn)。這時想要改善靈敏度可以從以下幾方面入手：

1）提高供試品的濃度：溶劑的限度是相對于供試品濃度計算的，提高供試品濃度也就相當(dāng)于提高了溶劑限度的絕對濃度，響應(yīng)也就相應(yīng)提高了。

2）調(diào)整分流比：一般情況下，為保護(hù)色譜柱和檢測器免受污染，分流比設(shè)置為10:1，也就是只有10%的樣品進(jìn)入色譜柱和檢測器，當(dāng)溶劑限度很低時，可以把分流比設(shè)置成5:1或2:1等，使流入色譜柱和檢測器的樣品比例更高，響應(yīng)自然也提高了。

3）提高頂空平衡溫度：頂空平衡溫度越高，達(dá)到氣液平衡時溶劑的濃度越高，我們在實際的方法開發(fā)中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)頂空溫度由90℃提高到110 ℃時，苯的峰面積提高了約1.6倍。

4）改為直接進(jìn)樣：如果頂空進(jìn)樣無法滿足要求，可以改為直接進(jìn)樣，靈敏度會大大提高，但是直接進(jìn)樣對色譜柱污染嚴(yán)重，應(yīng)慎重選擇。

第三、回收率偏低或偏高

造成回收率不符合要求的原因通常是基質(zhì)效應(yīng)，包括基質(zhì)減弱效應(yīng)和基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，造成的結(jié)果是回收率偏低和回收率偏高。

（1）回收率偏低

造成回收率低的原因包括供試品對待測溶劑有吸附作用、供試品與待測溶劑發(fā)生反應(yīng)和待測溶劑沸點過低，揮發(fā)損失等，相信大家在實際方法開發(fā)中遇到最多的基質(zhì)減弱效應(yīng)，也就是回收率偏低。

（2）回收率偏高

除了基質(zhì)減弱效應(yīng)，還有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，結(jié)果是回收率偏高，其原因是供試品占據(jù)了色譜系統(tǒng)中部分活性位點，減少了色譜系統(tǒng)與待測溶劑的反應(yīng)，造成待測溶劑響應(yīng)偏高。

解決基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)的方法包括1）在靈敏度允許的條件下適當(dāng)降低供試品溶度；2）加入一定量的分析保護(hù)劑，保護(hù)劑會與色譜系統(tǒng)中的活性位點發(fā)生反應(yīng)，達(dá)到保護(hù)殘留溶劑的作用。例如：某殘留溶劑回收率偏高，約為120%，當(dāng)向溶液中添加一定量醇類保護(hù)劑后，待測溶劑的回收率為103%左右，符合要求；3）當(dāng)以上方法不能解決時，可以采用終極方法，即采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定回收率，這樣可以完全消除對照溶液與供試品溶液基質(zhì)的差別。

要而論之，分析條件優(yōu)化的目的是采用最簡便的操作、在最短的時間內(nèi)達(dá)到符合要求的分離度、靈敏度和準(zhǔn)確度。如果在初始條件下難分離對的分離度就符合要求，那么我們可以通過調(diào)整升溫程序、流速等手段縮短分析時間，否則，我們應(yīng)設(shè)法提高分離度，當(dāng)然這個過程可能會損失一定的靈敏度和分析時間，我們所要做的是尋找其中的平衡點。

以上是我對于殘留溶劑方法開發(fā)的一些經(jīng)驗，希望能對大家有幫助。

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