Western Blot作為生物學研究中常用的蛋白質檢測技術，在大分子蛋白檢測方面有其獨特的要點與挑戰。了解并掌握這些注意事項，對于獲得準確、可靠的實驗結果至關重要。

1、電泳過程要點

1）對于大分子蛋白，首先要選擇合適的凝膠濃度。一般來說，較低濃度的凝膠（如6%-8%）更適合分離大分子蛋白，因為高濃度凝膠的孔徑較小，可能會阻礙大分子蛋白的遷移，導致條帶模糊或無法有效分離。

2）一般來說，大分子蛋白遷移速度相對較慢，過高的電壓可能會使蛋白條帶變形或出現拖尾現象。通常采用較低電壓（80V左右）長時間電泳的方式，以保證大分子蛋白能夠充分分離且條帶整齊。

2、轉膜步驟關鍵

1）大分子蛋白一般選用PVDF膜，通常PVDF膜比NC膜更適合大分子蛋白的轉膜，因為其具有更好的機械強度和蛋白結合能力。

2）濕轉轉膜的過程中一般采用較低的電壓（如30-60V）長時間轉膜（如1-2小時甚至更長時間），以保證大分子蛋白能夠充分轉移到膜上。

3）要注意防止氣泡的產生。

3、抗體孵育與檢測環節

1）抗體孵育時大分子蛋白需要更長的孵育時間（如4℃過夜），以確保抗體能夠充分與抗原結合。二抗孵育一般是在室溫下孵育1-2小時。

2）孵育完成后，在進行顯色或化學發光檢測前，要充分洗滌膜，以去除未結合的抗體，降低背景。

3）注意曝光時間，大分子蛋白的信號可能相對較弱或需要更長時間的曝光才能清晰顯示，需要通過多次嘗試不同的曝光時間來獲取最佳的檢測結果。

大分子蛋白的Western Blot實驗需要在每個環節都精心設計和嚴格操作。從電泳到最后的檢測，任何一個環節都不能忽視。