前置知識

RNA是一種很容易降解的物質，由于RNA是單鏈結構，且生活環境中RNA酶無處不在，因而我們在實驗室提取RNA時要格外小心，應全程無RNase環境中操作，并佩戴好口罩、手套等。

在這里我將介紹兩種實驗室提取RNA的常用方法，并給各位小伙伴們提供一些小tips，歡迎大家一起討論學習。

RNA提取的常用方法

實驗室常用的提取動植物組織、細胞RNA的方法：一是比較傳統的需要添加氯仿的RNA提取試劑，這里以Thermo Fisher 公司的Invitrogen TRIzol試劑為例（后文簡稱“TRIzol法”），由于氯仿是劇毒易揮發的危化品，現在也有許多產品是免除氯仿的RNA提取試劑，這里以Vazyme公司的FreeZol Reagent為例（后文簡稱“FreeZol法”）。

上述的兩種方法的基本原理均是使用單相裂解試劑進行RNA提取，該方法中，生物樣品被異硫氰酸胍和苯酚的單相溶液所破壞而裂解，然后加入氯仿（或溴氯丙烷），混勻后離心，勻漿被分離成水相和有機相，RNA僅存在于上層水相，而DNA處于水相和有機相的分界處，變性蛋白存在于下層有機相。

回收水相后，通過加入異丙醇沉淀RNA。

如果需要提取DNA和蛋白質，可以通過順序沉淀分離：中間相用乙醇沉淀得到DNA，從有機相中用異丙醇沉淀獲得蛋白質；

從中間相回收的DNA為20kb大小，可用做PCR的模板；然而由于暴露于胍鹽，蛋白質是變性的，因此主要用于免疫印跡。

實驗操作實例

接下來我將以果蠅成蟲為例詳細介紹兩種方法的步驟

樣本處理：

A. 組織樣本

1.將新鮮組織用液氮速凍，迅速轉移至液氮預冷的研缽中，用研杵研磨，期間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀(無明顯可見顆粒)。

▲研磨不徹底會影響RNA的得率和質量。

2. 將研磨成粉的樣品轉移至離心管中，大約每50 mg組織加入1mL TRIzol （500μL FreeZol Reagent）, 渦旋振蕩至充分裂解，室溫靜置5 min。

▲每500μL FreeZol Reagent最多可裂解50 mg動物/植物組織，過多的樣本量可能會導致裂解不充分，并使產物純度降低。肝臟、脾臟、腎臟等組織DNA/RNA含量豐富，過多樣本量還會導致gDNA殘留或產量降低。

▲若沒有條件用液氮研磨，可將新鮮組織盡量剪碎浸泡在單相裂解試劑中，用電動勻漿器高速勻漿至組織塊徹底裂解（這里我使用手動研杵研碎，手動研磨時應注意避免局部積熱，盡量在冰上進行）。

3. (可選)11,200 rpm(12,000 x g)室溫離心5 min。小心吸取上清至新的1.5 ml離心管，切勿吸取沉淀。

▲若樣本含有較多蛋白質、脂肪、多糖或肌纖維、植物塊莖等，可離心去除不溶物質，離心得到的沉淀包括細胞外膜、多糖、高分子量DNA，RNA存在于上清中。提取脂肪含量較高的組織樣本時，若上層含有大量油脂，應去除。轉移上清進行后續操作。

B. 懸浮細胞樣本

1.離心收集細胞，棄盡上清，每1×105~1×107個細胞加入1mL TRIzol （500μL FreeZol Reagent）。

2.渦旋振蕩或用移液器反復吹打直至充分裂解，室溫靜置5 min。

▲對于凍存細胞，加入FreeZol Reagent應立即進行振蕩,否則會導致裂解不充分。

C. 貼壁細胞樣本

1.棄去細胞培養液，用1×PBS清洗一次，棄盡廢液。

2.常規6孔板每孔或直徑3.5 cm平皿(約10 cm2培養面積)的細胞加入500μL FreeZol Reagent,每100mm平皿加入1mL TRIzol，使之充分覆蓋到細胞表面，然后用移液器反復吹打細胞使其脫落。

▲對于貼壁牢固的細胞(細胞團)可采用細胞刮或者潔凈的槍頭剝離，或增加單相裂解試劑的用量，亦可在加入單相裂解試劑之前采用胰酶將細胞消化下來，然后按照懸浮細胞處理。

3.將裂解液轉移至1.5 ml離心管，渦旋振蕩或用移液器反復吹打直至充分裂解，室溫靜置5 min。

▲浸在TRIzol試劑中的樣本可以在-60~-80°C存放至少一個月

TRIzol法提取RNA

1. 孵育勻漿樣品，室溫5min，以完全裂解核蛋白復合物；

2. 每毫升TRIzol加入0.2mL氯仿；蓋緊管蓋用力搖動15s，并在室溫下孵育2-3min；

▲不要渦旋樣品，因為它會導致DNA污染。

▲注意使溶液充分混勻為均一溶液，混勻不徹底影響RNA提取效率和雜質去除效率。

3. 4°C，12000g 離心15min，混合物分為三相，RNA僅存于上層水相；

4. 小心地將上層水相轉移至新Ep管內，注意不要擾動中間層；

▲每1mL TRIzol可獲得約600μL水相，為防止DNA污染推薦只回收500μL。

5. 每毫升TRIzol加入0.5mL異丙醇沉淀RNA，顛倒混勻，室溫孵育10min；

▲注意使溶液充分混勻為均一溶液，混勻不徹底將無法使RNA沉淀。

▲低濃度樣品中回收RNA時效率很低，可以在此步加入1μL糖原（20mg/mL）。

▲為防止溫度過高使RNA降解，也可以置于冰上、-20°C冰箱中進行沉淀。

6. 12000g離心10min，收集RNA沉淀；

7. 棄上清，并用吸頭完全去除殘留液體；

8. 用75%乙醇洗滌一次RNA沉淀，每毫升TRIzol加入至少1mL 75%乙醇，渦旋混合樣品液，然后在4°C 7500g離心5min；重復清洗一次；

▲沉淀于75%乙醇的RNA可儲存在2~8°C至少一周，-5~-80°C至少一年。

9. 完全去除乙醇，空氣干燥或真空干燥RNA沉淀10min；

▲除去乙醇后，沉淀應該是半透明的，在干燥時，沉淀將變成透明凝膠體狀。不要真空離心干燥的RNA。重要的是不要讓RNA沉淀完全干燥，因為這將大大降低其溶解度。

10. 用20~100μL的RNase free水溶解RNA，反復吹打幾次。

▲部分方案中建議在55-60°C溫育10min，這里我個人不建議進行加熱；若RNA過于干燥，可在40°C溫育直至其完全溶解。

FreeZol法提取RNA

1.向孵育勻漿樣品中加入Dilution Buffer。（動植物組織:每500μL FreeZol Reagent加入100μL Dilution Buffer；細胞:每500μL FreeZol Reagen加入150μL Dilution Buffer。）蓋緊離心管蓋，渦旋振蕩至溶液充分混勻，室溫靜置5 min。

▲振蕩時注意使溶液充分混勻為均一溶液，混勻不徹底影響RNA提取效率和雜質去除效率。

2. 12,000g室溫離心15 min。

3.小心取出離心管。此時樣本中蛋白質、DNA、多糖等雜質沉淀到管底，RNA分布在上層溶液中，小心吸取上清溶液(約500μL)至一個新的離心管中。

▲上層溶液的體積約占總體積的90%，用500μL FreeZol Reagent進行提取，上層溶液約為550μL ;吸到下層沉淀會導致基因組及雜質污染。

▲部分樣本上清輕微渾濁或有顏色，可繼續后續操作，不影響產量和純度。

▲組織投入量為50 mg時，吸取上清溶液體積建議減少至450μL ,防止吸到下層沉淀。

4.在得到的上清溶液中加入等體積異丙醇，上下顛倒充分混勻，室溫靜置10 min。

5. 12,000g室溫離心10 min,離心后在管側和管底可以看見白色凝膠狀沉淀，小心棄去上清，勿丟失沉淀。

▲RNA含量少會導致沉淀不明顯，小心棄去上清，勿丟失沉淀。

▲部分特殊樣本如:水稻葉RNA沉淀會分散在離心管壁上導致白色沉淀不明顯，小心棄去上清,步驟7離心后沉淀可見。

▲為減少雜質殘留，此步驟盡可能將上清棄干凈，勿丟失沉淀。

6.加入1 ml 75%乙醇。輕彈管底，讓沉淀懸浮起來，并上下顛倒數次。

7. 8,000 g室溫離心3 min,棄去上清，勿丟失沉淀。

8.重復步驟6和7一遍，棄盡上清。

▲為減少雜質殘留，應盡可能的將上清液棄干凈。建議棄去大部分上清后，短暫離心將所有液體甩至管底，再用移液器將剩余液體吸掉，注意不要吸到沉淀。

9.室溫放置晾干，加入20- 100μL RNase-free ddH2O溶解沉淀，室溫渦旋3 min(或使用移液器反復吹打)，使RNA沉淀充分溶解。提取的RNA產物可以分裝后在-85 ~ -65°C長期保存，在-30 ~-15°C短期保存。

▲通常，RNA沉淀晾干2 - 3 min即可，不要過度晾干，RNA完全干燥后會很難溶解。

▲RNA產物需要充分溶解，否則可能導致濃度定量失準。

RNA質量分析

使用超微量紫外分光光度計，測量提取RNA樣品的A230、A260、A280，用來計算RNA樣品的濃度、估計RNA純度。

計算溶液中RNA濃度的公式：RNA樣品濃度（μg/mL）= A260×40×稀釋倍數

A260不能區分RNA和DNA，因此，建議用無RNase的DNase處理RNA樣品去除DNA污染。

此外，污染物如苯酚和蛋白質會影A260的讀數; 苯酚在波長為260nm處有強烈的吸收,而芳香族氨基酸的吸收在280nm處。

在260nm處吸光度相對于280nm的吸光度比值( A260/A280)可以用來評估RNA樣品中蛋白質的污染水平。純的RNA的A260/A=值接近2.0。

如果有明顯的蛋白質或酚污染，A260/A280 比小于2.0，用紫外分光光度法將不可能準確定量核酸含量。

另一個比值A260/A230可用于評估有機化合物或高離液鹽( chaotropic salt)的污染水平，它們在波長230nm處有強烈吸收，導致低A260/A230。

理想情況下，提取RNA的A260/A230的比例應接近2.0。

▲A260/A280 比值依賴于pH和離子強度。隨著pH的增加，A280 降低, 但A260 不受影響，從而A260/A280的比值增加。因為純水pH為酸性，如果使用它們溶解RNA, A260/A280的比值可能偏低。因此為了準確的可重復的讀數，最好使用緩沖液如TE (pH 8.0)作為稀釋劑和空白對照。

瓊脂糖凝膠電泳分析：

提取的RNA質量優劣可以通過簡單的非變性瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用MOPS或TBE緩沖液、配制0.8%瓊脂糖凝膠，在4~5V/cm電壓下進行電泳，若RNA純度較好將會有清晰的三（四）條帶（28S、18S、5.8/5S）且亮度均一（上樣質量一樣）。

常見問題&解決方案