納米技術(shù)是指在原子及分子水平研究、制造并運(yùn)用納米材料(結(jié)構(gòu)尺寸在1-1000nm的材料)的技術(shù)[1]。在藥學(xué)領(lǐng)域里利用其較小的分子結(jié)構(gòu)，使很多生物活性物質(zhì)(藥物、核酸、多肽或蛋白質(zhì)等)可以通過(guò)納米技術(shù)來(lái)遞送[2]。這些新型納米給藥系統(tǒng)(包括脂質(zhì)體、納米乳劑和納米凝膠等[3])的出現(xiàn)提高了藥物的生物相容性、靶向性、緩釋性、穩(wěn)定性和表面修飾性等特性[4-5]，將納米技術(shù)在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用推向了新高潮[6-9]。

用適當(dāng)材料制成的大小在納米數(shù)量級(jí)的具有納米特性的粒子，被稱為納米載體。納米載體多采用可降解材料，如聚合物[10-13]、石墨烯[14-15]、蛋白質(zhì)[16-17]、糖類[18]等。其中蛋白質(zhì)具有較好的成膜功能及凝膠化、乳化和保水能力，使其作為納米載體，可與很多疏水性藥物復(fù)合，優(yōu)于其他納米給藥系統(tǒng)，表現(xiàn)更好的水溶性、靶向性、高生物利用度和低不良反應(yīng)[19-24]，并能增強(qiáng)穩(wěn)定性[25]。蛋白納米載藥系統(tǒng)常用的制備方法有:去溶劑化法、超聲乳化法、pH-凝聚法、快速膨脹超臨界溶液法、NabTM技術(shù)和自組裝法等[26-31]。

綜合近年國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，以蛋白質(zhì)作為納米載體的蛋白種類主要有以下幾種，見表1。

在以蛋白質(zhì)為納米載體的藥物制劑中，2005年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了American Bio Science公司注射用紫杉醇(白蛋白結(jié)合型，商品名為Abraxane)，成為全球首個(gè)蛋白納米制劑。該品種的上市應(yīng)用為很多難溶性藥物和靶向性差的藥物制劑提供了新思路、新方法，此外如多西紫杉醇、雷帕霉素、烯丙基氨基格爾德霉素的白蛋白納米制劑也已進(jìn)入臨床研究階段[40]。在該類藥物的研究過(guò)程中，運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)和方法建立的質(zhì)量控制體系以及其療效闡明了納米技術(shù)與蛋白質(zhì)為載體相結(jié)合的靶向藥物新劑型具有很好的發(fā)展前景[41-43]。本文主要對(duì)其近年來(lái)的質(zhì)量研究進(jìn)展和相應(yīng)的分析方法進(jìn)行綜述。

以蛋白質(zhì)為載體的納米制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)主要有：形態(tài)特征、粒徑大小及其分布、Zeta電位、包封率、含量測(cè)定、穩(wěn)定性、體外釋放、晶型狀態(tài)和溶血率等[44-47]，其中含量測(cè)定分為載體蛋白質(zhì)和目標(biāo)藥物測(cè)定。

1、 粒徑

藥物制劑的給藥途徑不同其粒徑標(biāo)準(zhǔn)要求也不同，藥物制劑的粒徑大小及粒徑分布決定其安全性、有效性、穩(wěn)定性，因此制定粒徑及粒徑分布范圍是藥物制劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。有文獻(xiàn)報(bào)道[48]在粒徑較小的范圍內(nèi)，可獲得較好的藥物包封率和載藥量及更好的穩(wěn)定性和靶向性。影響其粒徑及粒徑分布的因素主要有溫度、pH值、超聲條件等。因此，采用先進(jìn)的現(xiàn)代分析手段對(duì)以蛋白質(zhì)為載體的納米制劑的粒徑進(jìn)行測(cè)定，使操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠。

1.1 動(dòng)態(tài)光散射(DLS)法

2017年，Yildiz等[49]、Raei等[50]分別采用DLS法、Malvern激光粒徑儀對(duì)不同大小的納米粒進(jìn)行測(cè)定，或通過(guò)預(yù)處理，控制粒徑大小，并使其粒徑分布指數(shù)(PDI)在一定范圍內(nèi)。如Yildiz等[49]的研究得到其中最小粒徑為(27.1±1)nm的納米球聚集體，與其他樣品相比，增強(qiáng)了溶解度、抗氧化活性及功能性。

Shkodra-Pula等[51]在2019年通過(guò)DLS法分析顆粒粒徑和分散性，考察了不同表面活性劑對(duì)納米粒的穩(wěn)定性影響，結(jié)果表明，在150-220nm之間形成的納米粒是一個(gè)有利于靶向傳遞的粒徑范圍。

同年，Pradhan等[52]用Malvern激光粒徑儀通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法，測(cè)定其白蛋白納米粒徑為(137.63±6.42)nm和PDI為(0.195±0.014)，Zeta電位為(15±0.3)mV。細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果表明，該陽(yáng)離子化聚合物接枝白蛋白納米粒可以改變血腦屏障的通透性，具有較強(qiáng)的腦部靶向作用。

因此，通常采用DLS法測(cè)定以蛋白質(zhì)為載體的納米藥物制劑的粒徑及粒徑分布、Zeta電位[53]。Chen等[54]、Assadpour等[55]、Gul等[56]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)控制粒徑在<200nm的范圍內(nèi)可以獲得更好的生物利用度、抗氧化活性和穩(wěn)定性。

1.2 掃描電子顯微鏡《SEM)

邢化朝等[57]于2016年采用掃描電鏡法，分析放大3萬(wàn)倍下的掃描電鏡圖，通過(guò)校準(zhǔn)系數(shù)乘以平均粒徑得到最終平均粒徑為103.1nm，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)給定粒徑值吻合，結(jié)果可靠。雖然，掃描電鏡操作簡(jiǎn)便，容易觀察，但顯微鏡的體積大、成本高，且樣品必須承受極端的真空條件。因此，隨著現(xiàn)代分析儀器的進(jìn)步，一般僅采用掃描電子顯微鏡測(cè)定粒子形貌和初步粒徑分析。

1.3 透射電鏡(TEM)法

TEM是一種高分辨電子顯微鏡，可用于高分子、生物樣品的測(cè)定，且對(duì)樣品的損壞較小。代昭等[58]利用透射電子顯微鏡對(duì)納米粒子的形貌和粒徑進(jìn)行表征，從電鏡結(jié)果中可清晰觀察到粒徑為4nm左右的納米粒子，且粒徑分布較窄。

1.4 紫外-可見光譜(UV)法

UV法基于Beer-Lambert定律，主要用于對(duì)共軛有機(jī)化合物、過(guò)渡金屬和大分子的定量分析。由于大多數(shù)納米粒子都是彩色的，因此可以很容易地獲得它們的光學(xué)和光催化性能，可以利用該技術(shù)研究納米粒子的反射率、吸收、磷光和熒光等性質(zhì)，隨著納米粒子粒徑的增大，吸收光譜呈現(xiàn)紅移[59-61]。

2、 含量測(cè)定

2.1 白蛋白的測(cè)定

在藥學(xué)領(lǐng)域中以蛋白質(zhì)為載體的納米制劑，應(yīng)用較多為白蛋白。白蛋白性質(zhì)較穩(wěn)定，對(duì)pH值、溫度、有機(jī)溶劑都具有一定的耐受性，因而適用于多種納米粒的制備[62]，其中常用人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)作為納米載體。白蛋白在維持血漿壓力和營(yíng)養(yǎng)平衡中起著關(guān)鍵作用，化合物通過(guò)與血液中的白蛋白結(jié)合來(lái)運(yùn)輸。此外，人類健康與血清白蛋白濃度密切相關(guān)，需對(duì)蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。

2.1.1 一般方法

《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版中，采用免疫雙擴(kuò)散法和免疫電泳法鑒定白蛋白，凱氏定氮法對(duì)白蛋白成品進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定[63]。在以蛋白質(zhì)為載體的納米制劑中，電化學(xué)阻抗譜、近紅外漫反射譜、毛細(xì)管電泳和光散射技術(shù)等在檢測(cè)白蛋白時(shí)選擇性強(qiáng)、靈敏度高，但是操作步驟復(fù)雜、重現(xiàn)性差、費(fèi)時(shí)[64]。

2.1.2 高效液相色譜(HPLC)法 

白蛋白為大分子物質(zhì)，采用一般分析柱不能得到較好的分離結(jié)果，應(yīng)采用大分子填充柱。曲娜[65]在對(duì)人血清白蛋白體外分析方法建立中，采用色譜柱為Toso Hass TSK G3000PWXL柱(300mm X7.8mm，5um)，以0.1mol·L-1磷酸二氫鉀溶液[用鹽酸調(diào)pH至(7.0±0.1)]為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為228nm，柱溫為30℃，流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為20uL，對(duì)白蛋白進(jìn)行鑒別和含量測(cè)定。

因此，開發(fā)簡(jiǎn)便可靠、快速靈敏、準(zhǔn)確度高、選擇性強(qiáng)的新方法，對(duì)蛋白檢測(cè)極為重要。目前應(yīng)用研究較理想的檢測(cè)手段為生物傳感手段，其設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、精確度高，在最短的時(shí)間內(nèi)可檢測(cè)出微量的白蛋白[66]。

2.2 載藥含量的測(cè)定

2.2.1 前處理方法 

以蛋白質(zhì)為載體的納米藥物通常制備為凍干制劑，因此需要篩選合理的前處理方法，達(dá)到能夠準(zhǔn)確測(cè)定其復(fù)合物載藥量的目的。

閆淑娟[67]在對(duì)JD27白蛋白納米粒的初步性能研究中，取白蛋白納米粒適量，15000r·min-1離心30min后分離游離藥物，收集納米粒，用水稀釋適量，加入1mL乙腈沉淀蛋白，渦旋3min，超聲30min，12000r·min-1離心15min，取上清吹干，然后用1mL甲醇復(fù)溶后，測(cè)定白蛋白納米粒中藥物含量。

高越[68]在對(duì)紫杉醇白蛋白納米粒研究中表明，純化水溶解納米粒凍干粉后，取適量稀釋液于超濾離心管中，以12000r·min。超濾離心30min，取濾液進(jìn)行測(cè)定游離藥物含量。取納米粒加入適量乙腈溶解，超聲20min，將混合物以12000r·min-1離心10min，取上清液并進(jìn)行分析，測(cè)定納米顆粒中紫杉醇總含量。

邢高楊[69]在紫杉醇白蛋白納米粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中，采用0.9％氯化鈉溶液對(duì)蛋白納米粒進(jìn)行復(fù)溶，再用乙腈溶解紫杉醇白蛋白納米粒，渦旋1min后超聲15min，再在4℃下，以5000r·min-1離心10min，取上清液進(jìn)行紫杉醇含量測(cè)定，并對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

2.2.2 HPLC法 

以蛋白質(zhì)為載體的納米制劑中，測(cè)定復(fù)合物中的載藥含量，經(jīng)過(guò)前處理分離后，通常采用HPLC法對(duì)包載藥物進(jìn)行測(cè)定。Thao等[70]在測(cè)定阿霉素和紫杉醇白蛋白納米粒載藥量和包封率時(shí)，采用Agilent PLRP-S柱(150mmX4.6mm，8um)進(jìn)行反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析，并配置Agilent保護(hù)濾柱(5mm×3mm)，流動(dòng)相A[0.1％三氟乙酸(TFA)]和流動(dòng)相B(0.1％TFA乙腈)進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0mL·min-1，柱溫為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為220um。

2.2.3 其他測(cè)定方法 

在藥動(dòng)學(xué)及組織分布試驗(yàn)中，以蛋白質(zhì)為載體的納米制劑利用載藥含量小而發(fā)揮其緩釋作用，因此測(cè)定血漿中的藥物含量時(shí)，通常采用液相色譜二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)進(jìn)行分析[71-72]。

3、 藥量比

3.1 藥量比對(duì)粒徑的影響

以蛋白質(zhì)為納米載體的藥物制劑中，藥物和蛋白質(zhì)載體的比例對(duì)復(fù)合物質(zhì)量的影響較大。魏煒等[73]以牛血清蛋白為模型蛋白，N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)為單體，N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)為交聯(lián)劑，制備了蛋白納米膠囊，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，隨著藥物和蛋白比例的升高，蛋白納米膠囊的粒徑也逐漸增大。

3.2 藥量比對(duì)包封率和載藥量的影響

陳衛(wèi)[74]在伊曲康唑白蛋白納米粒性能研究中，設(shè)定牛血清白蛋白濃度為2％，與藥物溶液體積比為19:1，在藥物溶液濃度分別為25，50和75mg·mL-1下分別制備納米粒，結(jié)果表明，隨著藥物濃度增大，納米粒的粒徑隨之遞增，分別為(80.5±2.1)，(108.6±1.6)和(125.3±2.8)nm，載藥量明顯增加，分別為(5.5±0.2)％，(11.1±0.5)％和(14.2±1.1)％。

薛瑾[75]在茶多酚一蛋白納米復(fù)合物的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著茶多酚-酪蛋白比例增加，在茶多酚與酪蛋白的摩爾比為10:1時(shí)，納米復(fù)合物具有最小粒徑和最大包封率。

3.3 藥量比對(duì)穩(wěn)定性的影響

通常粒徑越小的蛋白納米制劑具有更好的穩(wěn)定性[76]。楊貴妃等[77]研究乳清蛋白與OSA變性淀粉質(zhì)量比從10:0變化到3:7的過(guò)程中，納米乳液的粒徑顯著增加，結(jié)果表明，隨著蛋白質(zhì)比例的減小，粒徑增大，乳清蛋白溶解度降低，乳化能力減弱，從而使納米乳液的穩(wěn)定性降低。

王霞等[78]考察了不同米糠蛋A與葡萄糖比值對(duì)米糠蛋白乳化活性及穩(wěn)定性的影響規(guī)律，結(jié)果表明，在蛋白與葡萄糖比例在1:1，1:2，1:3，1:4和1:5范圍內(nèi)，米糠蛋白乳化性和穩(wěn)定性先增強(qiáng)后降低，葡萄糖比例增大為米糠蛋白提供更多的糖基化結(jié)合位點(diǎn)，而高比例葡萄糖使體系黏度增大，從而降低米糠蛋白溶液的穩(wěn)定性。

3.4 藥量比對(duì)靶向作用的影響

楊惠卿等[79]在細(xì)胞攝取影響因素實(shí)驗(yàn)中，考察當(dāng)?shù)鞍准{米載體(HSP)亞基與聚乙二醇丙烯酸共聚物(PSPA)的摩爾比分別為1:1，1:2，1:3時(shí)，2種蛋白納米載體進(jìn)人倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞(CHL)細(xì)胞的情況，結(jié)果表明，投料比為1:1時(shí)無(wú)顯著差異，而投料比為1:2和1:3時(shí)有顯著差異，其抑制入胞作用顯著強(qiáng)于1:1，而投料比1:2與1:3相比無(wú)顯著差異。所以，當(dāng)HSP亞基與PSPA的摩爾比超過(guò)1:2時(shí)，PSPA包衣可對(duì)pH敏感型熱休克蛋白納米載體(PT-HSP)進(jìn)入正常細(xì)胞發(fā)揮抑制作用。

藥物和蛋白質(zhì)的用量比例對(duì)納米復(fù)合物的粒徑、包封率和穩(wěn)定性的影響較大，還可影響其靶向作用。因此，控制以蛋白質(zhì)為載體的納米制劑的藥量比，是保證藥物滿足穩(wěn)定性和藥物制劑要求的重要因素和指標(biāo)。

4、 穩(wěn)定性

藥物的物理化學(xué)性質(zhì)可能受濕度、光照、高溫等影響，使其降低或失去活性，甚至產(chǎn)生毒性副產(chǎn)物。以蛋白質(zhì)為納米載體可以通過(guò)多種結(jié)合方式與藥物形成納米復(fù)合物，以有效降低其毒副作用，提高藥物穩(wěn)定性及靶向結(jié)合率[80]。

4.1 溶劑對(duì)穩(wěn)定性的影響

以蛋白質(zhì)為載體包載疏水性藥物的納米制劑可溶于水、甲醇、乙醇、乙腈等溶劑，對(duì)復(fù)合物溶液中的藥物溶解后進(jìn)行提取、分離，而以蛋白質(zhì)為載體的納米制劑的穩(wěn)定性在不同介質(zhì)中表現(xiàn)的性能不同。Rohiwal等[81]考察了在不同生物介質(zhì)中牛血清蛋白納米制劑的穩(wěn)定性，研究表明，在葡萄糖、純化水、NaCl溶液中的穩(wěn)定性均高于磷酸鹽緩沖液(PBS)。因此在含量測(cè)定、臨床使用和貯藏運(yùn)輸過(guò)程中要考察溶劑對(duì)該類復(fù)合物穩(wěn)定性的影響。

4.2 pH對(duì)穩(wěn)定性的影響

溶液的pH環(huán)境會(huì)影響以蛋白質(zhì)為載體的納米制劑的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，在不同的pH條件下，納米制劑具有不同的結(jié)構(gòu)，牛血清白蛋白是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，它的等電點(diǎn)一般在4.8-5.6[82]。Doost等[83]報(bào)道在制備樹膠-乳清蛋白納米復(fù)合物后，為改善其穩(wěn)定性，討論了不同pH下，以粒徑和外觀形狀為指標(biāo)，評(píng)價(jià)復(fù)合物的穩(wěn)定性，結(jié)果表明pH值為4-5時(shí)比在pH值為3-4時(shí)更能誘導(dǎo)納米復(fù)合物的穩(wěn)定性。

Siri等[84]對(duì)牛血清A蛋白納米粒采用FT-IR光譜實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同pH條件下蛋白納米結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在pH2.0和9.0條件下，光譜發(fā)生藍(lán)移，檢測(cè)波長(zhǎng)向左移動(dòng)，而在pH7.0時(shí)，牛血清白蛋白納米粒更能保持納米粒自身的結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性更好。

5、 展望

近年來(lái)，在創(chuàng)新藥物及藥物新劑型的質(zhì)量研究中，主要通過(guò)制定各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)滿足藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求，保障藥品使用安全、有效和合理。在以蛋白質(zhì)為載體的納米制劑中，粒徑作為該類制劑的主要質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[85-87]，其測(cè)定手段也需方便、快速、靈敏且有效。探索合理的前處理方法，運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)手段建立快速、方便、靈敏的測(cè)定方法，評(píng)價(jià)和控制蛋白納米制劑的粒徑、包封率和載藥量等，使其符合藥物制劑質(zhì)量要求。

此外，由于這類納米制劑制備工藝的復(fù)雜性和貯存條件的苛刻要求，必須加強(qiáng)其穩(wěn)定性研究。而且目前對(duì)此類復(fù)合物在溶解、釋放、降解后產(chǎn)生的有關(guān)物質(zhì)研究報(bào)道較少，其相關(guān)研究需要進(jìn)一步探索和完善。同樣，藥物的安全性評(píng)價(jià)也是藥物研究非常重要的環(huán)節(jié)。其不良反應(yīng)可能是來(lái)自起始物料、中間體以及在生產(chǎn)、貯存過(guò)程中引入或受貯運(yùn)條件影響而發(fā)生變化產(chǎn)生的有關(guān)物質(zhì)。隨著蛋白納米制劑的廣泛應(yīng)用，其質(zhì)量控制研究中有關(guān)物質(zhì)檢查已成為重點(diǎn)，并具有較大的研究空間。

文章作者 | 張金霞，李楠，李曉琴，王倩文，鄧盛齊（成都大學(xué)抗生素研究與再評(píng)價(jià)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川抗菌素工業(yè)研究所）

文章來(lái)源 | 中國(guó)新藥雜志 2021年2月 第30卷4期333-338頁(yè)