引物是一種短的DNA或RNA序列，用于在PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）和其他分子生物學(xué)技術(shù)中擴增和檢測特定的DNA或RNA序列。

 

引物通過與目標序列的互補堿基配對來定向擴增所需的DNA或RNA片段。在分子生物學(xué)研究中，引物的設(shè)計是非常重要的一步，因為它直接影響到PCR擴增的特異性和靈敏度。

 

一、普通PCR與熒光定量PCR引物設(shè)計上的相同注意點

 

1.序列的查找是一致的，在NCBI上搜索不同物種的同一基因，序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，選擇合適片段長度

 

2.引物長度（primer length）常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38bp，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度太高，不適合 DNA 聚合酶進行反應(yīng)

 

3.3’端最好不要有A，5’端可以容忍二聚體，但3’端一定不要有二聚體

 

4.不要有連續(xù)的GGG 或CCC、GCGC、CGCG之類，不要有錯配，前后引物的退火溫度要差不多，差異在2度以內(nèi)

 

5.避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)

 

6.Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%

 

7.引物之間的TM相差避免超過2℃

 

8.引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基，引物3'端要避開密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。

 

9.引物的設(shè)計好后使用Blast 驗證

 

各種模板的引物設(shè)計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如 GC 含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標都十分合適的引物；

 

用作克隆目的的 PCR，因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。

 

如果實在滿足不了這么多要求，那么就：

 

1、引物與模板配對好；

 

2、兩個引物退火溫度差不多；

 

3、每個引物的 GC 含量不要太高或太低；

 

4 、引物最好沒有回文序列；

 

就這 4 點就很好了。如果還是滿足不了！只要前2點就夠了。

 

二、熒光定量引物的特定要求

 

做熒光定量PCR時，用SYBR Green I 法時的一對引物與一般 PCR 的引物，在引物設(shè)計上所要求的參數(shù)是不同的。

 

熒光定量PCR引物設(shè)計的要求：

 

1、避免重復(fù)堿基，尤其是 G.

 

2、引物的退火溫度要高，一般最好要在 60 度以上；

 

3、GC含量40-60%.

 

4、3'端最后 5 個堿基內(nèi)不能有多于 2 個的 G 或 C.

 

5、正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。

 

6、引物的產(chǎn)物大小不要太大，80～150 bp 最為合適。

 

三、引物設(shè)計后的NCBI BLAST引物驗證

 

BLAST 的作用應(yīng)該是通過比對，發(fā)現(xiàn)你所設(shè)計的這個引物，除了和你的目標基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當中存在相同的序列；

 

如和你的目標序列之外的序列相同的序列，則可能擴出其他序列的產(chǎn)物，那么這個引物的特異性就很差，從而不能用。

 

以HSP70為例

 

F:ATGTTGCTCTCTCCAAGAATAACGTT

 

R:TCAGTTCTTCTCCTCCTTCTTTTCCTG

 

1、未克隆全長序列

 

方法一

 

(1)

 

 

(2)

 

 

(3)

 

 

 

(4)

 

 

(5)

 

 

方法二

 

(1) 

 

引物中間空一格

 

 

 

(2)  

 

數(shù)據(jù)庫選nr比較全面

 

選擇你物種的拉丁學(xué)名

 

 

 (3)  

 

相似比較

 

 

 (4)  

 

一一對應(yīng)直線,即為完全匹配

 

2、克隆全長序列

 

>HSP70表示該序列名稱

 

>+名稱

 

(1)  

 

(2)  

 

(3)  

在本條序列中引物特異性較好

 

參考資料：

 

https://www.labmanager.com/benefits-of-electronic-pipettes-533

 

https://www.snapgene.com/guides/polymerase-chain-reaction