目前來(lái)說(shuō)，外泌體是一種能夠被絕大多數(shù)活細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞外囊泡，直徑一般30-150nm之間，可以攜帶包含核酸、蛋白質(zhì)、多糖等內(nèi)容物，并可以傳遞到鄰近細(xì)胞從而影響細(xì)胞的生理功能。

研究外泌體的第一步就是我們?nèi)绾雾樌墨@得外泌體，其中超速離心法（差速離心法 ）是比較傳統(tǒng)的分離外泌體的方法 ，另外還有密度梯度離心、超濾離心、PEG-base沉淀法、磁珠免疫法和目前比較便捷的利用試劑盒提取。在這里主要介紹一下傳統(tǒng)的超速離心法和試劑盒提取分離外泌體。

1、超速離心法

超速離心法是最常用的分離外泌體的方法，主要是通過(guò)離心機(jī)的低速離心和高速離心交替進(jìn)行從而分離到直徑大小相近的細(xì)胞外囊泡，具體流程如下：

2、試劑盒提取、分離外泌體

（1）分離樣本類型：細(xì)胞上清/尿液、血清/血漿，樣本不同所使用的試劑盒也有所不同。

（2）分離原理：離心去除細(xì)胞碎片/上清，試劑結(jié)合外泌體，純化獲得外泌體。

（3）大致過(guò)程：去除細(xì)胞碎片——獲取細(xì)胞上清或血清上清——加入外泌體沉淀/結(jié)合試劑——靜置結(jié)合外泌體——離心去除上清——出現(xiàn)白色沉淀（外泌體）——PBS/無(wú)核酶水溶解外泌體沉淀（RNase-free Water）——利用純化柱純化外泌體——低速離心——外泌體（-80℃保存）。

（4）注意事項(xiàng)：

① 保證一定的樣本量，在血清、血漿、尿液等臨床樣本樣本等有限的情況下可以根據(jù)外泌體提取試劑的加入的量進(jìn)行調(diào)整；目前我們分離較多的樣本應(yīng)該是來(lái)自細(xì)胞的外泌體，因此為了獲取較大量的外泌體，我們前期可用T75瓶或100cm的細(xì)胞培養(yǎng)多培養(yǎng)大量細(xì)胞。

② 若獲取的細(xì)胞外泌體仍需要進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)探究，其中我們用到的完全培養(yǎng)基層（1640/DMEM+FBS+PS）內(nèi)的血清需用到去除外泌體的血清（可購(gòu)買也可通過(guò)差速離心進(jìn)行去除但成本較高）。

③ 目前，研究比較熱的就是探究外泌體中的內(nèi)容物被攜帶到靶細(xì)胞而發(fā)揮的作用，特別是RNA。經(jīng)過(guò)多次使用外泌體試劑盒分離獲取外泌體中的RNA，分離得到的RNA濃度都比較低且純度不高，如圖1。

圖1

④ 不管我們利用什么方法分離獲取外泌體，其中最關(guān)鍵的一點(diǎn)還是要證明我們獲取的物質(zhì)到底是不是外泌體，這就涉及外泌體的表征鑒定。通常的方法如下：

Western blot 鑒定外泌體的表面標(biāo)志蛋白（CD63、CD9、CD81以及TSG101、HSP70）

電鏡分析外泌體的大小形態(tài)（透射電鏡TEM，掃描電鏡SEM）

檢測(cè)外泌體的粒徑及濃度（納米顆粒示蹤分析NTA，DLS粒度分析）

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)粒徑及細(xì)胞表面標(biāo)志物

⑤ 分離外泌體的過(guò)程可能要用的15/50ml離心管的離心機(jī)，但是這個(gè)比較大型的離心機(jī)對(duì)于管子的配平十分重要，嚴(yán)格一些的可能還需要對(duì)要離心的管子進(jìn)行稱重配平，另外離心機(jī)也會(huì)設(shè)置最高轉(zhuǎn)速的限制。因此我們離心的過(guò)程需要格外注意，或者進(jìn)行2ml或5ml的離心管進(jìn)行分裝用小型的離心機(jī)進(jìn)行高速離心，但是這種情況會(huì)導(dǎo)致收集濃度降低。

⑥沉淀外泌體這一步驟中，我們可能并不能看見(jiàn)外泌體沉淀，因此我們可以有技巧的記住離心管的的擺放位置，并去除上清。