摘 要： 建立超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜法同時測定增乳膏中6種成分（鹽酸水蘇堿、王不留行黃酮苷、鹽酸益母草堿、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷）。樣品經甲醇超聲提取，采用Waters XBridge BEH C18色譜柱分離，流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，流量為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣體積為2 μL。采用電噴霧電離源（ESI源）、正負離子同時監測、多反應監測（MRM）模式掃描。6種成分在各自質量濃度范圍內與對應色譜峰面積呈良好的線性關系，相關系數均不小于0.999 8，方法檢出限為0.035～0.535 ng/mL，定量限為0.100～1.605 ng/mL。樣品加標平均回收率為98.08%～103.11%，測定結果的相對標準偏差為1.94%～3.67%（n=6）。該方法適用于同時測定增乳膏中6種成分的含量，可為增乳膏的質量標準修訂提供參考。

關鍵詞： 增乳膏； 超高效液相色譜-串聯質譜法； 鹽酸水蘇堿； 王不留行黃酮苷； 鹽酸益母草堿； 芍藥苷； 阿魏酸； 毛蕊花糖苷

 

增乳膏是由王不留行、通草、熟地黃、當歸、白芍、川芎、益母草、天花粉8味中藥材組成的中藥復方制劑[1]，具有補血活血、通絡催乳的功效[2]，主治婦女產后氣血虛弱所致的乳汁不行。鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿、王不留行黃酮苷、芍藥苷、阿魏酸及毛蕊花糖苷為《中華人民共和國藥典》中上述各味藥材的質量控制成分。隨著現代分析儀器的發展進步，中藥復方制劑正在從傳統的單一指標檢測發展到多指標檢測[3]。增乳膏現行國家藥品標準[WS-5163(B-0163)—2014Z]中，僅采用高效液相色譜(HPLC)法測定芍藥苷的含量，目前尚無多成分檢測的報道。色譜-質譜聯用技術集色譜的高分離能力和質譜的高專屬性于一體，具有選擇性強、靈敏度高、分離能力好等優點[4]，在多組分同時檢測方面相比二極管陣列檢測器具有明顯的優勢[5]，近年來已廣泛應用于中藥復方制劑的定量分析[6]。筆者建立超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜(UPLC-MS/MS)法同時測定增乳膏中鹽酸水蘇堿、王不留行黃酮苷、鹽酸益母草堿、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷6種成分的含量，可以為增乳膏的質量控制提供科學依據。

 

1、 實驗部分

 

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀：Waters XEVO TQ-S型，沃特世科技(上海)有限公司。

電子分析天平：(1)XS204型，感量為0.1 mg；(2)XPR205/A型，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多國際貿易上海有限公司。

超聲波清洗儀：KQ-600VSM型，昆山市超聲儀器有限公司。

對照品：鹽酸水蘇堿(質量分數不小于99.2%)、王不留行黃酮苷(質量分數不小于97.1%)、鹽酸益母草堿(質量分數不小于98.1%)、芍藥苷(質量分數不小于94.6%)、阿魏酸(質量分數不小于99.4%)、毛蕊花糖苷(質量分數不小于95.2%)，中國食品藥品檢定研究院。

乙腈、甲醇：均為色譜純，德國默克股份聯合公司。

增乳膏樣品：漳州片仔癀藥業股份有限公司。

實驗用水：蒸餾水，屈臣氏集團(香港)有限公司。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜儀

色譜柱：Waters XBridge BEH C18色譜柱[100 mm×2.1 mm，2.5 μm，沃特世科技(上海)有限公司]；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈-0.1%(體積分數)甲酸水溶液(體積比為18∶82)，流量為0.3 mL/min；進樣體積：2 μL。

1.2.2 質譜儀

離子源：ESI源；監測模式：正負離子同時監測；掃描模式：MRM模式；離子源溫度：150 ℃；毛細管電壓：0.5 kV；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/h；各目標成分的質譜參數見表1。

表1   目標成分質譜參數

Tab. 1   Mass spectrometry parameters of target components

注：帶*號的為定量離子。

 

1.3 樣品處理

取增乳膏約5 g，精密稱定，加適量甲醇于100 mL容量瓶中，超聲處理30 min (功率為300 W，頻率為40 kHz)，冷卻后用甲醇定容至標線，搖勻，以4 000 r/min轉速離心5 min，精密吸取上清液1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至標線，搖勻，過濾，取續濾液，制得樣品溶液。

1.4 溶液配制

單成分對照品儲備液：精密稱取鹽酸益母草堿對照品10.34 mg、阿魏酸對照品10.72 mg及毛蕊花糖苷對照品10.17 mg，分別置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至標線，精密吸取上述溶液各1 mL，分別置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至標線，分別制成質量濃度為1.014 4 μg/mL的鹽酸益母草堿溶液、1.065 6 μg/mL的阿魏酸溶液和0.968 2 μg/mL的毛蕊花糖苷溶液。精密稱取對鹽酸水蘇堿照品11.11 mg、芍藥苷照品12.02 mg，分別置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至標線，分別制成質量濃度為110.211 2 μg/mL的鹽酸水蘇堿溶液、113.709 2 μg/mL的芍藥苷溶液。精密稱取王不留行黃酮苷對照品11.02 mg，置于200 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至標線，制成質量濃度為53.502 1 μg/mL的王不留行黃酮苷溶液。

混合對照品溶液：分別精密吸取單成分對照品儲備液鹽酸水蘇堿溶液2 mL、王不留行黃酮苷溶液0.5 mL、鹽酸益母草堿溶液5 mL、芍藥苷溶液2 mL、阿魏酸溶液5 mL、毛蕊花糖苷溶液1.5 mL，置于同一只50 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至標線，搖勻，制成含鹽酸水蘇堿4.408 4 μg/mL、王不留行黃酮苷0.535 0 μg/mL、鹽酸益母草堿0.101 4 μg/mL、芍藥苷4.548 4 μg/mL、阿魏酸0.106 6 μg/mL、毛蕊花糖苷0.029 0 μg/mL的混合對照品溶液。

系列混合對照品溶液：精密吸取混合對照品溶液0.5、2.5、5、10、25、50 mL，分別置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至標線，搖勻，配制成系列混合對照品溶液，各溶液的質量濃度見表2。

表2   系列混合對照品溶液質量濃度

Tab. 2   The mass concentration of series mixed reference solution ( μg/mL )

 

1.5 實驗方法

取系列混合對照品溶液及樣品溶液，按1.2儀器工作條件進樣分析，記錄色譜峰面積，按外標法計算增乳膏中6種成分的含量。

 

2、 結果與討論

 

2.1 提取溶劑和提取時間選擇

分別選擇甲醇、體積分數為50%的甲醇水溶液、體積分數為70%的甲醇水溶液為提取溶劑，分別超聲提取30、45、60 min，考察增乳膏中6種成分的提取效果。結果表明，相同超聲時間下，甲醇的提取效果最好，30 min即可提取完全，故選擇甲醇為提取溶劑，提取時間為30 min。

2.2 流動相選擇

分別考察甲醇-0.1%(體積分數，下同)甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L甲酸銨)、乙腈-0.1%甲酸水溶液及乙腈-0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L甲酸銨) 4種流動相體系。結果表明，在甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L甲酸銨)流動相體系中，鹽酸益母草堿、王不留行黃酮苷和毛蕊花糖苷色譜峰形較差且峰寬較大，而在乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L甲酸銨)流動相體系中，各待測成分響應均較高，色譜峰形良好，由于甲酸銨對離子響應的提高作用不大，且容易對儀器造成污染，因此選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

2.3 質譜條件優化

通過查閱鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿[7?9]、王不留行黃酮苷[10]、芍藥苷[11?12]、阿魏酸[13?15]、毛蕊花糖苷[16]相關文獻及調諧質譜參數，選擇響應較大、色譜峰形較好的離子對及參數作為各成分的定量離子對和定性離子對，優化結果見1.2.2。

2.4 專屬性試驗

取混合對照品溶液及樣品溶液，按1.2儀器工作條件進樣分析，結果顯示，樣品溶液各成分色譜峰形良好，對應色譜峰保留時間與相應對照品溶液一致，無其他干擾，專屬性良好。混合對照品溶液及樣品溶液的MRM色譜圖如圖1所示。

圖1   混合對照品溶液及樣品溶液MRM色譜圖

Fig. 1   MRM chromatograms of mixed reference solution and sample solution

A—混合對照品溶液；B—樣品溶液

 

2.5 線性方程、檢出限與定量限

按1.2儀器工作條件測定系列混合對照品溶液，記錄色譜峰面積。以各對照品溶液的質量濃度為橫坐標(x)，色譜峰面積為縱坐標(y)，進行線性回歸，計算線性方程和相關系數。

將各單成分對照品儲備液不斷稀釋，按1.2儀器工作條件進樣分析，以信噪比為3∶1時的質量濃度為各成分的檢出限；信噪比為10∶1時的質量濃度為各成分的定量限。各成分質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量限見表3。

表3   質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量限

Tab. 3   Linear range of mass concentration，linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit

 

2.6 精密度試驗

精密稱取同一批增乳膏樣品(編號S1)，按1.3方法平行制備6份樣品溶液，并按1.2儀器工作條件進樣測定，結果見表4。由表4可知，鹽酸水蘇堿、王不留行黃酮苷、鹽酸益母草堿、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷測定結果的相對標準偏差分別為1.98%、2.95%、2.49%、1.94%、2.02%、3.67%，表明方法精密度良好。

表4   精密度試驗結果

Tab. 4   Results of precision test

 

 

 

2.7 穩定性試驗

取同一增乳膏樣品(編號S1)溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8、12、24 h后進樣測定，結果見表5。由表5可知，鹽酸水蘇堿、王不留行黃酮苷、鹽酸益母草堿、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷測定結果的相對標準偏差分別為0.21%、1.41%、0.99%、2.11%、2.52%、3.51%，表明樣品溶液在室溫條件下24 h內穩定性良好。

表5   穩定性試驗結果

Tab. 5   Results of stability test

 

2.8 樣品加標回收試驗

精密稱取9份已知含量的增乳膏樣品(編號S1)各約2.5 g，精密稱定，分別加入相當于各目標成分已知量的80%、100%、120%的對照品，每個水平各3份，按1.3方法制備加標樣品溶液，并按1.2儀器工作條件進樣測定，結果見表6。由表6可知，各目標成分的加標平均回收率為98.08%～103.11%，表明該方法準確度良好。

表6   加標回收試驗結果

Tab. 6   Results of spiked recovery test

 

3、 結語

 

建立超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜(UPLC-MS/MS)法可以同時測定增乳膏中6種成分的含量。該方法穩定、可靠、簡便快捷，彌補了增乳膏現行國家藥品標準[WS-5163(B-0163)—2014Z]只檢測單一成分的不足，可為增乳膏的質量標準修訂提供參考。

 

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引用本文： 黃淑芬 . 超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜法同時測定增乳膏中6種成分［J］. 化學分析計量，2024，33（9）：22. (HUANG Shufen. Simultaneous determination of six components in Zengru Gao by UPLC-MS/MS[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(9): 22.)