前言

隨著生物醫藥行業的快速發展，越來越多的多肽藥物被開發用于治療各種疾病。但是由于多肽口服生物利用度差需要注射給藥，會降低患者的依從性，尤其對于需要長期治療的疾病。口服給藥是較為理想的給藥方式，但多肽藥物在胃腸道穩定性差、分子量大、難以透過腸道上皮等特點均限制了其開發口服制劑。隨著對多肽口服吸收機理的深入了解，科學家開發的技術手段打破了多肽胃腸道吸收的壁壘，一些口服多肽藥物已經成功上市。

下表1總結了已上市吸收入血的口服多肽藥物，數量仍然比較有限。環孢菌素為分子量1202.61的環肽，是第一個上市的口服多肽藥物。但是環孢菌素本身的分子量較小，環肽的結構也增加了穩定性。環孢菌素上市之后多年，口服多肽藥物一直沒有取得顯著性進展。直到2019年口服司美格魯肽上市，采用促滲透劑SNAC增加多肽的胃腸道吸收，為口服多肽的研發開辟了新的路徑。口服胰島素的開發可謂歷史悠久，這一構想始于1922年[1]。但直到2023年，全球首款口服胰島素腸溶膠囊Oramed才在中國申報上市。

表1. 已上市吸收入血的口服多肽藥物

1、提高多肽口服吸收的策略

多肽藥物想要達到理想的口服吸收，往往需要多維度的助力。

結構優化：針對多肽鏈的結構修飾，防止多肽在胃腸道水解，提高多肽的胃腸道穩定性；提高多肽的體內代謝穩定性，延長生物半衰期。

促滲透劑：通過促滲透劑改變胃腸道上皮的緊密連接，提高滲透性，也是目前口服多肽的常用策略。常見的促滲透劑包括表面活性劑癸酸鈉、辛酸鈉，螯合劑EDTA、檸檬酸等。

制劑手段：比如自乳化制劑，通過提高難溶性藥物在胃腸道的溶解度，促進吸收；腸溶膠囊可避免多肽藥物在胃部釋放，減少胃內降解等。

pH調節劑：胃腸道的酶活性與pH值息息相關，pH調節劑可通過改變胃腸道局部的pH值，影響酶的活性，減少多肽在胃腸道的降解。

2、研究口服多肽胃腸道吸收的評估體系

對于口服多肽的早期篩選評價，需要確認多肽能否通過口服吸收，以及影響多肽口服吸收的主要因素，并進行有針對性地優化，以提高多肽的口服生物利用度。本文主要關注胃腸道對多肽吸收的影響，因此主要介紹胃腸道吸收相關的體外和體內研究體系。

1、體外胃腸液穩定性

胃腸道中含有大量的蛋白水解酶，可使多肽在胃腸道產生降解。所以多肽在胃腸液中的穩定性是影響口服吸收的第一道屏障。Wang等人[2]研究了17種肽類藥物在胃腸道的穩定性，結果表明在人胃液中，分子量較小的肽表現出良好的穩定性；在人小腸液中，環狀的肽具有相對較好的穩定性。根據模擬胃腸液穩定性的結果，可有針對性地設計多肽在特定部位吸收，或優化多肽的結構來提高胃腸道中的穩定性。

2、體外細胞模型

Caco-2被認為是體外評估腸道滲透性的金標準。Caroline等人[3]采用Caco-2細胞，評估SNAC和癸酸鈉(C10)的促滲透作用以及促滲透的機理。結果顯示（見圖1），C10可降低Caco-2細胞單層膜的跨膜電阻（TEER），并在8.5 mM和10 mM濃度下顯著增加了熒光探針FITC-4000（熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖）的滲透性。而SNAC除了在40 mM濃度下對TEER 和FITC-4000的滲透性產生顯著影響，其他濃度下對這兩個參數都沒有影響。相關機理研究顯示，C10可引起Caco-2細胞中三種緊密連接蛋白（claudin-5, ZO-1和occludin）的重組，而SNAC只影響了claudin-5的定位。因此，根據研究目的可選擇Caco-2評價促滲透劑對多肽滲透性的影響。也有文獻報道人工生物膜PAMPA也可用于多肽的體外滲透評價[4]。但如果評價促滲透劑的作用，根據其作用機理，建議選擇Caco-2細胞模型而非人工生物膜用于評價。

針對多肽類等低滲透性化合物，藥明康德DMPK部門開發并驗證了過夜預孵育方法，通過將測試化合物與細胞預孵育20小時以上，再加入測試化合物進行雙向滲透試驗，來評估化合物的滲透性。此方法在細胞預飽和的基礎上，能夠有效測得化合物的滲透性，也可用來篩選不同促滲透劑的促滲作用。

圖1. C10（左圖A和C）和SNAC（右圖B和D）對Caco-2細胞單層膜的影響[3]

NCI-N87是從一名男性胃癌患者的胃中分離出的具有上皮形態的細胞系[5]，很少用于腸道滲透性評價。但是由于口服司美格魯肽的相關機理研究發現，其吸收部位主要是胃。因此研究者采用NCI-N87細胞單層進行體外滲透研究。結果顯示在20 mM至80 mM的SNAC濃度范圍內，司美格魯肽的Papp值隨著SNAC的濃度增加而增加，見圖2。NCI-N87細胞攝取試驗結果也顯示，SNAC可提高司美格魯肽的細胞內攝取。

圖2. NCI-N87單層細胞中不同SNAC濃度對司美格魯肽體外滲透系數Papp值的影響[5]

3、尤斯灌流（Ussing chamber）模型

Ussing chamber模型可以在體外研究特定腸段的滲透，且為了排除漿膜層和肌肉層對藥物滲透的影響，可對腸段進行剝膜處理僅保留粘膜層。藥物的吸收過程發生在粘膜表面，而漿膜層和肌肉層對于滲透性本身較差的化合物可能產生不利影響。在多肽的滲透性研究中，經常會用到多種促滲透劑，高濃度的促滲透劑可能影響腸道活性。Ussing chamber模型可通過檢測電生理參數，對腸道活性進行監測。此外，與腸灌流或腸外翻實驗相比，Ussing chamber模型操作簡單，具有更高的通量。Ussing chamber模型比較適合評價口服多肽的體外滲透性。

Stephen等人[6]采用Ussing chamber模型，研究SNAC對司美格魯肽在大鼠胃黏膜的滲透性影響。大鼠胃黏膜在SNAC中持續暴露10分鐘，接著移走SNAC，分別在10分鐘，30分鐘和60分鐘加入司美格魯肽。結果顯示，司美格魯肽的滲透性在10分鐘加入時最高，30分鐘和60分鐘加入時已經恢復到基線水平，見圖3。說明SNAC的促滲透作用是短暫的。

圖3. 大鼠胃黏膜中SNAC對司美格魯肽的滲透性影響[6]

Sarinj等人[7]采用Ussing chamber模型，研究SNAC增強奧曲肽在大鼠和人腸上皮粘膜的滲透性，見圖4。研究結果顯示，添加20 mM SNAC可增加奧曲肽在大鼠不同腸段上皮粘膜的通透性，Papp分別為：結腸（增加3.2倍）>回腸（3.4倍）>空腸（2.3倍）>十二指腸（1.4倍）>胃（1.4倍）。添加20 mM或40 mM SNAC也能增加奧曲肽在人結腸粘膜的通透性，Papp分別增加了1.5倍和2.1倍。添加SNAC后，特別是在結腸區域，跨膜電阻（TEER）值降低。該結果顯示出SNAC可作為奧曲肽的腸滲透促進劑。

圖4. 奧曲肽在大鼠各腸段（左圖）和人結腸（右圖）上皮粘膜的滲透性[7]

Foger等人[8]采用Caco-2單層細胞模型和Ussing chamber的腸粘膜模型，評價可溶性多肽的體外滲透性，并與體內進行比較。結果顯示，Ussing chamber的腸粘膜模型測得的Papp值與體內生物利用度具有非常好的相關性（R2=0.81），Caco-2模型測得的Papp值與體內生物利用度的相關性較差（R2=0.48）。

4、體內PK研究

口服多肽的體內PK研究方面，需要選擇相關動物種屬進行藥代研究，且考慮到體內吸收較差，血藥濃度較低，對于分析檢測靈敏度也具有更高的要求，有能力的情況建議做到pg/mL級別。另外還需要關注是否需要禁食，多肽在腸道的吸收部位，以及促滲透劑的劑量設計等問題。

食物影響：口服司美格魯肽的體內藥代研究發現，食物的存在會影響口服多肽的吸收，空腹狀態下生物利用度更高。因此口服多肽的PK研究，推薦在空腹條件下進行[6]。

圖5. 健康受試者在餐后和空腹條件下口服司美格魯肽的血藥濃度時間曲線[9]

吸收部位：在胃腸道中，小腸具有最大的表面積，且小腸膜也比胃的更易穿透，因此大多數藥物主要在小腸吸收。但是研究發現胃也可能是口服多肽的主要吸收部位?？诜久栏耵旊脑谟拈T結扎和非結扎的犬中吸收是相當的，且在犬脾靜脈中的血藥濃度大大高于肝門靜脈，說明口服司美格魯肽的主要吸收部位是胃而不是小腸[6]。另外，在腸道中通過淋巴系統吸收來提高治療性多肽的口服生物利用度的效果是非常有限的。

圖6. 口服司美格魯肽在幽門結扎和不結扎的Beagle犬中吸收曲線（左圖）和口服司美格魯肽在犬脾靜脈和肝門靜脈中的吸收曲線（右圖）[6]

促滲透劑：人體內給予5 mg的司美格魯肽，分別合用150 mg，300 mg或600 mg的促滲透劑SNAC，結果顯示合用300 mg SNAC的司美格魯肽血漿暴露量最高。過高劑量的SNAC可能產生鹽析作用，反而不利于多肽的口服吸收[6]。此外，同樣的促滲透劑對不同的多肽可能具有不同的作用。比如在大鼠體內，SNAC可以促進司美格魯肽的口服吸收，但是卻不能促進利拉魯肽的口服吸收。而促滲劑也可促進淋巴吸收，在前期公眾號文章“大鼠腸系膜淋巴管插管模型驗證滲透促進劑SNAC對淋巴吸收的影響”中已有詳細介紹。

結語

本文從口服多肽的研究目的著手，介紹了用于評價多肽藥物胃腸道吸收的研究方法和數據解讀?？诜嚯牡奈蛰^差，血藥濃度較低，一般需要非常高的檢測靈敏度。藥明康德DMPK在口服多肽的藥代動力學研究方面積累了豐富的經驗，可開發具備高選擇性、高靈敏度和寬線性范圍的多肽生物分析方法。在體外Caco-2細胞模型上，已經完成數百個多肽化合物的體外滲透性評價。Ussing chamber模型是比較推薦的針對口服多肽的體外研究模型，藥明康德DMPK部門已經建立了Ussing chamber模型用于體外滲透性評價，尤其在腸道剝膜技術和腸粘膜的質量把控方面積累了豐富的經驗。借助多種不同類型的針對口服多肽胃腸道吸收的評價體系，我們希望可以助力口服多肽的早期研發。

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