摘 要： 采用紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定對乙酰氨基酚片含量，評估測定結(jié)果的不確定度。通過不確定度來源分析，建立數(shù)學(xué)模型，量化不確定度分量，計算出測定值的不確定度結(jié)果及各分量的貢獻(xiàn)率。不確定度的主要來源為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及樣品處理過程，其次為紫外儀器和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制。當(dāng)k=2時，按置信區(qū)間為95%，對乙酰氨基酚片百分標(biāo)示量含量測定值為（99.55±2.48）%。不確定度評估可以用于分析和優(yōu)化紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定藥品含量的過程，對藥品的質(zhì)量控制和方法改進(jìn)有重要的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞： 紫外； 標(biāo)準(zhǔn)曲線法； 對乙酰氨酚片； 含量測定； 不確定度

 

對乙酰氨基酚片是一種常見的解熱鎮(zhèn)痛藥，臨床上應(yīng)用非常廣泛[1]。對其進(jìn)行含量測定是片劑質(zhì)量控制的重要手段，從而保證臨床用藥劑量的準(zhǔn)確性。對乙酰氨基酚的含量測定方法有紫外可見分光光度法、高效液相色譜法、近紅外光譜法等[2?4]。紫外可見分光光度法操作簡單、方便，分析成本低，更易普及。《中華人民共和國藥典》（2020年版）采用UV吸收系數(shù)法，按C8H9NO2的吸收系數(shù)圖片715計算片劑含量，目前尚未報道采用紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定對乙酰氨基酚片含量。由于實際測定中受多種因素影響，吸收系數(shù)可能會有偏差，參考2023年全國職業(yè)院校技能大賽“ZZ012食品藥品檢驗賽項規(guī)程”建立了UV標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定對乙酰氨基酚片含量[5]。為減少測量誤差使測定結(jié)果準(zhǔn)確性更加可靠，根據(jù)JJF 1059.1—2012 《測量不確定度評定與表示》和JJG 196—2006 《常用玻璃量器檢定規(guī)程》要求，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6?11]，同步進(jìn)行了含量測定不確定度的分析，為提高對乙酰氨基酚片含量測定方法和結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性提供科學(xué)依據(jù)。

 

1、 實驗部分

 

1.1 主要儀器與試劑

紫外分光光度計：UV-1800PC-DS2型，上海美普達(dá)儀器有限公司。

電子天平：ME204E型，感量為0.000 1 g，瑞士梅特勒-托利多公司。

吸量管：5、10 mL，均為A級，德國普蘭德公司。

容量瓶：100、250 mL，均為A級，德國普蘭德公司。

對乙酰氨基酚對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%，批號為23120437，壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

對乙酰氨基酚片：規(guī)格為0.3 g/片，批號為221204，山西汾河制藥有限公司。

氫氧化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實驗用水：純凈水（滿足實驗用水一級水），杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.1 mg/mL，取對乙酰氨基酚對照品0.25 g，精密稱定，加0.4%氫氧化鈉溶液50 mL溶解，轉(zhuǎn)移至250 mL量瓶中，加水稀釋定容，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液；精密量取10 mL，置于100 mL量瓶中，加水稀釋定容，搖勻。

對乙酰氨基酚系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密量取0.1 mg/mL對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL，分別置于7只100 mL容量瓶中，分別加入0.4%氫氧化鈉溶液10 mL，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻，質(zhì)量濃度分別為0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 μg/mL。

1.2.2 樣品處理

取對乙酰氨基酚片20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于對乙酰氨基酚40 mg），置于250 mL量瓶中，加入0.4%氫氧化鈉溶液50 mL與水50 mL，振搖15 min，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置于100 mL量瓶中，加入0.4%氫氧化鈉溶液10 mL，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻。

1.2.3 測定方法

（1）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立。于257 nm波長處測定系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

（2）樣品含量測定。取供試品溶液，于257 nm的波長處測定吸光度，由測得吸光度從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線查出目標(biāo)溶液中對乙酰氨基酚的濃度，計算對乙酰氨基酚片百分標(biāo)示量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

1.2.4 數(shù)學(xué)模型

對乙酰氨基酚片標(biāo)示百分含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）按式（1）計算：

 

(1)

式中：——質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

ρx——樣品溶液對乙酰氨酚質(zhì)量濃度，g/mL；

V1——樣品初次定容體積，mL；

V2——樣品稀釋時移液管移取體積，mL；

V3——樣品最后稀釋定容體積，mL；

mx——樣品片粉的稱取質(zhì)量，g；

——樣品平均片重，g/片；

ms——樣品標(biāo)示質(zhì)量，0.3 g/片。

 

2、 測量不確定度來源

 

根據(jù)1.2.4建立的數(shù)學(xué)模型和測量過程分析，紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定對乙酰氨基酚片含量的不確定度來源包括：

（1）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的不確定度urel(S1 )；

（2）系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度urel(S2)；

（3）平均片重引入的不確定度urel( )；

（4）樣品處理引入的不確定度urel(X )；

（5）紫外儀吸光度示值引入的不確定度urel(I )；

（6）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(L )；

（7）重復(fù)性測量引入的不確定度urel(R )。

 

3、 不確定度分量的評定

 

3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel (S1)

3.1.1 對照品純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel (P)

對乙酰氨基酚對照品物質(zhì)證書顯示其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%，擴(kuò)展不確定度Us=0.5%，ks=2，則對照品純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

按照矩形分布，k=，則對照品純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(P) =

3.1.2 對照品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(mr)

選用感量為0.1 mg的天平稱量對乙酰氨基酚對照品，所得稱量值為0.250 9 g。依據(jù)天平說明書參數(shù)，該天平的最大允許誤差為±0.5 mg，按照均勻分布，k=，則稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

u (mr)=

采用減重法稱量對照品，經(jīng)過2次稱量，因此對照品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel (mr)=

3.1.3 對照品稀釋定容體積引入的相對不確定度urel(Vs1)

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋定容包括250 mL容量瓶初始定容、10 mL分度吸量管移液和100 mL容量瓶稀釋定容帶來的相對不確定度，主要由體積校準(zhǔn)和溫度變化兩方面引入。根據(jù)JJG 196—2006 《常用玻璃量器檢定規(guī)程》規(guī)定的相應(yīng)容量瓶和吸量管的最大允許誤差，已知水的平均體積膨脹系數(shù)為2.04×，可認(rèn)為溶液的體積膨脹系數(shù)與其相接近，高硼硅玻璃的膨脹系數(shù)約3.3×，相對于水的膨脹系數(shù)，可忽略不計[12?13]。設(shè)實驗室的溫度在±5 ℃范圍內(nèi)變化。刻度吸量管、容量瓶和溫度變化引入的定量偏差均視為矩形分布k=，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量見表1。

表1   標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量

Tab. 1   Relative standard uncertainty components introduced by dilution volume of standard working solution

 

 

根據(jù)表1中各分量，合成得標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(Vs1)==3.14×

將urel (P)、urel (mr)、urel (Vs1)三項合成，得對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(S1)==3.82×

3.2 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S2)

已知水體積膨脹系數(shù)，設(shè)實驗室的溫度在±5 ℃范圍內(nèi)變化。刻度吸量管、容量瓶和溫度變化引入的定量偏差均視為矩形分布，k=，移液和定容部分分量值同表1。由對乙酰氨基標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，需選用10 mL刻度吸管移取標(biāo)準(zhǔn)工作溶液移液6次，100 mL容量瓶定容7次，合成得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel (S2)==7.55×

3.3 平均片重引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel()

取對乙酰氨基酚片20片，使用感量為0.1 mg的天平稱量總重，依據(jù)3.1.2，天平稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

u1()=

按照2020年版《中華人民共和國藥典》四部通則中重量差異檢查法，精密稱定每片質(zhì)量，計算得平均片重為346.4 mg，標(biāo)準(zhǔn)偏差s =3.54 mg，則藥品平均片重引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[14]：

u2 ()==0.79 mg

由平均片重引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

uc ()==0.84 mg

由平均片重引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel()=

3.4 樣品處理引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)

3.4.1 樣品片粉稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(mx)

使用感量為0.1 mg的天平稱量片粉，所得稱量值mx=44.6 mg，依據(jù)3.1.2，天平稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

u(mx)=

則片粉稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(mx)=

3.4.2 樣品溶液稀釋定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vx)

樣品溶液稀釋定容引入的不確定度包括250 mL容量瓶初始定容、5 mL分度吸管移液和100 mL容量瓶稀釋定容引入的不確定度，依據(jù)3.1.3，5 mL刻度吸量管校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

=1.44 mL

溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

mL

合成5 mL刻度吸量管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(V5)=2.94

合成樣品溶液稀釋定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(Vx)==3.13×

將樣品稱量和稀釋定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成，即得樣品處理引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel (X)==7.21×

3.5 紫外儀吸光度示值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(I)

測量吸光度引起的不確定度主要由UV計透射比允許誤差引起，采用B類評定[15]。校準(zhǔn)證書得知UV計的透射比示值（T）誤差為0.30%，已知A=lgT=0.542 5，則T=0.286 7，T的相對誤差為0.30%，即T=0.286 7±0.003，T∈(0.283 7，0.289 7)，計算可得A∈(0.538 1，0.547 1)，分布半寬=（0.547 1-0.538 1）/2=0.004 5，按矩形分布計算，取k=，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度：0.004 5/k=2.60×，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(I)=4.79×

3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel (L)

在257 nm處測定對乙酰氨基酚系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個質(zhì)量濃度點(diǎn)測定3次，共21次，系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液吸光度結(jié)果見表2。

表2   系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液吸光度

Tab. 2   Absorbance of series standard working solution

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法擬合，即得線性回歸方程y=ax+b。其中斜率a=0.070 575，截距b=0.001 707，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。

回歸曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)差：

S(A)=

對供試品溶液測量3次，平均吸光度為0.542 5，代入回歸方程計算得平均質(zhì)量濃度為ρ0=7.710 6 μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度：

u(L)=

式中：p——每份樣品溶液平行測量次數(shù)，p=3；

n——系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液重復(fù)測定次數(shù)，n=21；

——系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度的平均值，圖片=4.441 9 μg/mL；

計算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程引入的不確定度：

u (L)=1.12× μg/mL

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

urel(L)=

3.7 重復(fù)性測量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel (R)

對供試品進(jìn)行6次獨(dú)立重復(fù)試驗，測量均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(R)=/，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)=u(R)/，結(jié)果數(shù)據(jù)見表3。

表3   測量重復(fù)性引入的不確定度

Tab. 3   Uncertainty introduced by repeatability

 

3.8 合成、擴(kuò)展與報告不確定度的計算

綜上可知，所建方法引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(w)由標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制、系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制、平均片重、樣品處理、紫外儀器、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和重復(fù)性試驗產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量合成得：urel(w)=1.25。

樣品中對乙酰氨基酚片含量最終測定結(jié)果X為99.55%，由此得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

u= urel(w)×X=1.24%

取置信水平為95%，包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度U=u×k=2.48%。

紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定對乙酰氨基酚片含量測定結(jié)果可表示為（99.55±2.48）%，k=2。

3.9 不確定度貢獻(xiàn)率的計算

各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量及貢獻(xiàn)率統(tǒng)計結(jié)果[16]見表4。

表4   各不確定度分量計算結(jié)果及貢獻(xiàn)率

Tab. 4   Calculation results and contribution rate of each component uncertainty

 

 

 

4、 結(jié)論

 

結(jié)合不確定度評定結(jié)果和不確定度貢獻(xiàn)率分析可知，該方法測量不確定度主要來源于系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制和樣品處理過程，其次為紫外儀器和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制，因此在實驗過程中，應(yīng)選擇最大允差較小的A級移液管和容量瓶，定期校準(zhǔn)維護(hù)天平和紫外儀器，同時需要實驗人員嚴(yán)格按照操作規(guī)程，熟練規(guī)范操作，從而減小分析結(jié)果的不確定度，提高結(jié)果的準(zhǔn)確度。

樣品片粉需稱取質(zhì)量約40 mg，而該方法采用感量為0.000 1 g的天平，可能導(dǎo)致相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的放大。在實際工作過程中，有條件的可以選擇精度更高（感量為0.000 01 g）的天平，從而減小稱量引入的不確定度。若采用感量為0.000 01 g的天平，可以將對照品的稱取質(zhì)量縮小至25 mg，同時只需采用250 mL量瓶直接溶解不需要再進(jìn)行稀釋，從而節(jié)約試劑同時可降低不確定度。

通過分析比較各不確定度分量的大小，可發(fā)現(xiàn)對檢測結(jié)果影響較大的環(huán)節(jié)，進(jìn)而重點(diǎn)控制該環(huán)節(jié)的不確定度來源，從而為進(jìn)一步提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性提供依據(jù)。同時引入測量不確定度后，檢測結(jié)果不再是單一數(shù)值，而變?yōu)楸粶y值可能分布的區(qū)間范圍，由“檢測值±擴(kuò)展不確定度（U）”表示，可避免碰到檢測值處于限值邊緣附近時的誤判，從而有效提高檢驗結(jié)論的科學(xué)性和可靠性[17]。

 

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引用本文： 陳月琴，馬明，唐利宇，等 . 紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定對乙酰氨基酚片的不確定度評定［J］. 化學(xué)分析計量，2024，33（8）：118. (CHEN Yueqin, MA Ming, TANG Liyu, et al. uncertainty evaluation of content determination of acetaminophen tablets by UV standard curve method[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(8): 118.)