清潔驗證的目的是為了證明清潔程序的高效性與一致性。選擇產品殘留、清潔劑、微生物污染，以及其他任何工藝成分的限度，邏輯上應該基于物料對生產流程和產品的安全性和純度的影響而定。清潔生產系統和成分的可接受限度應該“切合實際、可達到、可證實”。

清潔驗證的限度一般包含與活性蛋白 （或者其他的主要物質成分） 相關分析、與清潔劑相關的分析、與生物負載水平相關的分析、與內毒素水平相關的分析，以及設備目檢清潔要求。另外，如果存在任何與活性蛋白或者其他工藝組分相關的特別毒性物質（例如細胞毒性、變應原性、或者生殖危害物），那么生產商的毒理學或生理學團隊就需要確定是否有必要改變限度，或者是否需要使用專用的設備。在接下來的討論中，限度的考慮應該基于自然殘留和生產的各個階段（例如，原液 vs.配制/分裝）。生產階段包括主要原液生產（所有的步驟是為了獲取活性藥物）和配制/分裝（將原液加入到成品的制劑以及藥品物質的初級包裝）。原液的生產進一步分為上游生產步驟（收獲藥物前的所有步驟）和下游生產步驟（藥物純化以及后續步驟）。

1、活性物限度的關鍵問題

生物技術的清潔過程經常涉及到活性分子本身的改變，因為這些活性物質通常是蛋白質。在生物制品制造通常應用的清潔過程中，蛋白質都會在一定程度上發生降解。下面就總結一下最主要的降解機制。在堿性溶液中，尤其是高溫，溶液中含有氫氧化鈉和氫氧化鉀，蛋白質就會水解成可溶的寡聚物或者自由氨基酸。活性物質上的酯基團水解為一個醇和一個脂肪酸，一個最為普遍的例子就是將脂肪和油脂轉化為甘油和脂肪酸的皂化反應。次氯酸鈉有時會用于生物技術清潔， 作為一種清潔劑， 它能非常有效地從表面去除變性蛋白質殘留。

它是一種活潑的氧化劑，它能夠使蛋白質更隨機地降解為更小的片段。使用次氯酸鈉時通常關注其對不銹鋼成分的危害作用。因此， 關鍵的是，使用次氯酸鈉后的漂洗循環能將氯離子殘留沖洗干凈，然后再進行酸清潔。在高 pH 下蛋白會水解，控制時間和溫度參數都會在很大程度上影響蛋白質的水解。因此，pH 和溫度越高，蛋白就越容易發生水解。因為蛋白通常降解為更為小的片段，這些小片段趨向于高度極化，他們更加易于溶于水，也更加容易通過清潔、漂洗的過程從設備表面去除。蛋白質暴露于高 pH 的第二個效果就是，水解導致其生物學活性的下降可能是一個不可逆的、顯著的過程。

活性物的降解可以在實驗室中驗證，通過將活性物質暴露在模擬清潔條件（或者強度更低的條件）的清潔溶液中，然后對生成的混合物進行分析和/或者生物化學的測試。基于這些原因，在大多數情況下生物技術制造商在清潔驗證流程中并不直接設置活性限度，或者直接檢測活性。由于活性物質的降解，在清潔過程完成后，應該不會有活性物質的殘留。正是出于這個原因，人們用像 TOC{總有機碳（Total organic carbon）}的分析方法檢測蛋白質的殘留物 （或片段）。如像 TOC 的非特異性的方法被用于活性物質殘留的檢測等相關使用， 應該指出，清潔后真正的蛋白質殘留是非常低的，因為 TOC 檢測的是所有的有機碳源（并不僅僅是來源于活性蛋白的殘余）。

1.1 在制劑和最終分裝中建立活性物限度

在生物技術產品的制劑和分裝生產中，蛋白質活性限度的設定是用污染(傳遞)量計算(通常稱為MAC，或最大可允許的傳遞量)，跟小分子清潔驗證使用同樣的方法。雖然產品降解(如上所述)，計算是基于活性產品的量。如果在制劑/分裝所用的清潔方法導致了活性蛋白降解為小分子片段， 該方法就代表了最差的情況。考慮到降解作用，這個計算可以進行修正。只有當每日治療劑量是已知的，才能應用這種方法。對于長期使用的產品，一個典型的方法是，在隨后制造最大活性日治療劑量的產品中，允許其攜帶不超過最小活性日治療劑量的 1/1000；1/1000的因子可能根據特殊情況而修訂。此外，如果計算允許在隨后的藥物產品中活性蛋白殘留量超過10ppm，可以使用在下一批次的藥物產品中，10 ppm 活性藥物蛋白的限度。類似的標準在包括美國FDA(8)和 PIC/S 的指導文件中是有例子的。

然后單位面積的限度可以基于下一個最小批量的藥物生產所共用的設備面積上計算出來。擦拭或沖洗樣品中的限度可以通過采樣的參數計算出來。當使用這個方法設定限度時，活性物的限制可以計算出來。然后它可以轉換為分析方法適當的單位而被利用。例如，如果分析方法是 TOC，活性物質的限度可以通過轉換為 TOC，即基于 TOC 在活性物質的含量（百分比）而計算出來。

應該指出的是，基于污染量（傳遞量）計算的限度是設置限度的“科學根據的”方法之一。一些公司選擇基于更嚴厲的標準設定限度，例如用 WFI TOC 值 500ppb 作為標準。雖然這種方式是可以接受的，但是只有證明 WFI TOC 標準要比污染量計算的 TOC 結果更加嚴格，才可以使用這種方法。

1.2 在原液生產中建立的活性物限度

用于制劑/分裝的污染量計算通常不適用于原液的生產。主要的原因是如果污染量計算的方法是基于整個生產線的設備表面積，限度是極低的，除非藥物活性成分在清潔過程中不會降解，否則是不能用現行分析技術測量的。

正如前面討論的，活性蛋白在大多數情況下，都會在清潔過程中被降解。因此，即使典型的特異性方法可以在很低水平上測量活性物質，但是當活性分子降解后這些方法是不能使用的。

如上所述，活性物的殘留一般都是像 TOC 一樣通過“間接”測量某一特性（為了這個報告的目的，TOC 將作為此類分析方法的例子，盡管也可以用總蛋白測量之類的方法）。

通常清潔驗證 TOC 的定量限度大約為 100-500 ppb 碳，與含碳量為 50%的約 200-1000 ppb 蛋白質的數值等效。因此說如果限度是基于整個設備鏈的表面積而計算污染量的，那么 TOC 是不能用作分析方法的。一些公司選擇使用一些限制區域的表面積計算污染量，例如使用最后一個生產罐或用最后一步純化工藝后的所有生產設備。這樣的修訂也許會導致計算的污染量，可以用 TOC 測定。這種方法的原理可以在 ICH Q7（藥物活性成分的 GMP 指南）中找到；在指南的 12.7 章節中提到如果在隨后的生產步驟中去除這些殘留物，在早期的生產步驟中不需要驗證。發酵和處理后的各種工藝步驟，包括層析純化及超濾等，預期可以去除早期清潔過程中所留下的殘留物，因為這些殘留物通常是小分子片段。這一點對于一個特定的活性物還沒有被證實，而是根據對蛋白質降解的理解以及生產工藝中所使用的各個純化工序的了解，所做的一個合理假定。在污染量計算的依據中，應考慮活性蛋白的滅活。這將導致一個保守的限度，因為它假定降解碎片的藥理學作用和/或安全考慮是遠遠低于天然蛋白質的。

由于這些測量問題，也由于降解的問題，一個更普遍的設定活性物殘留限度的技術是基于工藝能力。這不是一個真正的工藝能力研究，而是基于在生物產品制造中已有的和傳統的清潔操作程序來實現的。這些限度通常基于所有樣品的 TOC 值，不論是沖洗或擦拭。作為一般規則，那些純化工藝后的限度應更加嚴格。上游工藝的 TOC 限度通常會嚴格性差一些，因為設備表面清潔的產品會有更多外來材料的（例如細胞物質）。

可接受標準通常為下游工藝 TOC 1-2ppm 和上游工藝 TOC5-10ppm。就像其他清潔驗證方案一樣，應該注意，通常獲得的數值應顯著低于既定的限度。但是對于如超濾膜和色譜樹脂這些產品專用材料來說是可以有例外的。這些都是下游工藝的一部分，但是可以設定更高的限度值。當這些對象只是專門用于制造一種產品時，更高水平的限度是可以接受的。

1.3 基于毒理學的限度

一種為制劑/分裝或者原液生產而建立活性物限度的替代方法，是基于毒理學計算而建立的限度。這些活性物的毒理學計算與在下文第二部分第一小節市售化學試劑的限度中所提到的清潔劑毒理學計算是類似的。毒理學計算通常涉及活性物質短期的毒理學數據，最后到達一個 ADI（允許的日攝入量）。基于同一種用藥途徑（如果是注射給藥的產品應通過靜脈注射來研究）的毒理學數據計算會更好。如果數據是基于口服的毒理學，對注射藥的清潔應要求增加安全系數。作為一個總的看法，這種基于對安全考慮而進行的計算，與基于劑量的計算相比，通常會導致較高的限度。此外，如果活性蛋白降解，更多的相關毒理學數據不是天然蛋白質的毒理學，而是降解碎片的毒理學，通常認為后者安全問題更少（雖然通常不會進行降解碎片的毒性研究）。

2、清潔劑的限度

清潔劑的限度也取決于生產的各個階段（制劑/分裝與原液生產）。典型的生物制藥清潔程序包括強堿清洗以及下一步的磷酸物的清洗，或者是堿性清潔劑以及隨后的酸性清潔劑。這些過程都是分開處理的。

2.1 市售化學試劑的限度

如果只有市售化學試劑如氫氧化鈉和磷酸用于清潔，那么通常的做法是用電導率的值為其設定間接的限度。更好的做法是，氫氧化鈉或者磷酸的可接受水平建立在毒理學的污染量計算或者是工藝參數的效果之上。然后電導率限度的設定水平就等同于在特定溫度下的那個濃度。這種情況下用這種方法設置電導率的限度，通常要好于在相同溫度下注射用水的電導率限度。因此，限度是基于注射用水的標準或者是稍高于這個標準（例如 5 μS/cm）。這種做法的原因是它要比“科學”計算的限定值更加嚴格。此外，在許多情況下，磷離子/或鈉離子可能是隨后制造出來產品的一部分。因此，少量的污染量并不明顯。

還應指出的是，基于市售化學試劑的毒性計算是比較極端的，因為氫氧化鈉并不會以氫氧化鈉的形式污染到最終的產品中，磷酸也不會以磷酸的形式污染到最終產品的。如果這些化學物質以高濃度完整地污染下來，通過工藝檢查（這樣會引起 PH 的顯著變化）也會發現這種不符合性。因此，目標并不要求與注射用水的標準一致，而是確認一個很低的清潔劑含量。而允許電導率限度略高于注射用水限度的原因是，注射用水的限度要求只是適用于管路中的循環注射用水。一旦從循環管路中取出水并通過清潔設備（尤其是通過噴淋裝置時它可以從空氣中攝取二氧化碳），不要期望它一定會滿足 WFI 的電導率限度。

2.2 處方清潔劑的限度

對于制劑/分裝制造，處方清潔劑（可能在無機氫氧化物中添加很多有機組分）殘留量的限度通常是依據其短期毒性（LD50）數據而計算污染量的。這種毒性資料可提供的清潔劑制造商或可使用的計算制訂成分分析的基礎上最壞情況的假設。這種毒理學的資料可由制造商提供或使用基于處方成分分析得出的最差情況而計算。為了確定下一個藥物產品中的限度值，如果處方清潔劑的默認值比污染量計算的值更加嚴格，也可以采用。

處方清潔劑的默認值一般為 10ppm。請注意活性物污染量計算與處方清潔劑污染量計算的差異在于對后續產品的污染限度計算方法不同，一個使用的是劑量比率，而另一個用的是半致死率 LD50 比率。一旦完成計算，隨后的清潔劑計算使用與活性物同樣的公式，來確定每個拭子或每個分析樣品的限度。

對于原液生產，為活性物限度而討論的一些問題也同樣適用于清潔劑。也就是說，考慮到整個共享面積的污染量計算值是極低的，通常難以測量。但是，使用的處方洗滌劑通常在分離提純等過程中可根據分子量去除（例如超濾或者是分子排阻色譜法）。就像活性成分的限度一樣，毒性計算可能適用于下游純化后的步驟或下游工藝的最后一個容器。

3、微生物限度

考慮到清潔后微生物的限度，不要預期清潔過程本身會導致設備的無菌結果。然而，即使如果設備進行在位滅菌或者是在下一產品生產前滅菌，通常的做法是評估微生物負載來確保隨后的生產工藝不會過度挑戰。只要達到一般的非無菌生產微生物限度標準（1-2CFU/cm2 表面取樣方法）就已經是足夠的。對于沖洗取樣，一些公司將利用典型 WFI 的值（10 CFU/100 毫升），而其他公司將利用 100CFU/100 毫升或 1,000 CFU/100 毫升的值。設定較高的限度原因是隨后設備將進行滅菌。此外，WFI的值是在管路中循環的注射用水值，一旦它從循環管路中取出并加到設備中時，并不要期望它能必然符合原有的注射用水值。

4、內毒素限度

在內毒素經各個去除步驟后，內毒素對最終產品的污染量是更值得關注的。在這種情況下，內毒素通常只在最后的沖洗水測定，限度設定通常是注射用水標準 0.25EU/ml。在細胞培養過程的內毒素去除步驟之前，沖洗水取樣預期應該符合注射用水限度。對于用大腸桿菌進行的細菌發酵（革蘭氏陰性細菌，在沖洗過程中能夠生產大量的內毒素），在發酵和收獲步驟后的清洗符合注射用水限度，是不可能完成的，這種情形下，其它公司在更高的水平設置內毒素限度，例如 5-25 EU/mL。實現這一水平表明清潔工藝得到控制，任何在這種水平上的可能污染量應在隨后的內毒素清除工序中評價。

5、視覺清潔標準

產品表面的外觀目測是核實殘留物去除的一種直接衡量手段。外觀目測也不是一種定量的方法，但是對于直接檢查產品表面清潔非常有用。只要有路徑可以到達關鍵的表面，外觀目測很容易完成。它能確認生產設備重要區域的潔凈程度。文獻表明少量的殘留（如果存在）是可見的和可被察覺的。如同在生物制藥中所使用的，目測清潔標準能典型地用做清潔驗證方案中的擦拭和/或沖液中殘留物的測試。

6、修改限度

設立行動和/或警戒限度，作為日常工藝驗證監測的一部分。這些值通常比驗證方案中的合格/失敗限度更加嚴格。依據工藝能力顯示連續的低水平和維持這些水平的能力，可以進行風險評估并考慮為將來的驗證方案采用更加嚴格的限度。

本文作者劉生巧，甘肅三泰綠色科技有限公司，來源于現代鹽化工，僅供交流學習。