冷凍電鏡使用流程

冷凍電子顯微學解析生物大分子及細胞結構的核心是透射電子顯微鏡成像，其基本過程包括樣品制備、冷凍、透射電子顯微鏡成像、圖像處理及結構解析等幾個基本步驟，如下圖所示。

圖. 冷凍電子顯微學解析結構基本步驟

1、樣品制備

冷凍電鏡的樣品制備是整個流程中非常關鍵的一步。首先，需要選擇適合冷凍電鏡觀察的樣品，如蛋白質、細胞或病毒等。然后，將樣品制備成純凈的溶液或懸浮液。接下來，將樣品滴在特制的網格上，并通過吸附或冷凍的方式將樣品固定在網格上。

2、冷凍

冷凍是冷凍電鏡中非常重要的一步，它能夠保持樣品的原始結構。冷凍的主要目的是使樣品迅速冷卻到液氮溫度，避免樣品在冷凍過程中發生結構變化。通常，可以使用液氮冷凍樣品，或者將樣品暴露在液氮中的乙烷中進行冷凍。

3、電子顯微鏡掃描

在冷凍樣品制備完成后，需要將樣品放入電子顯微鏡中進行掃描。在電子顯微鏡中，樣品受到電子束的照射，并通過透射電子顯微鏡模式觀察樣品的結構。通過調整電子束的條件和樣品的位置，可以獲取不同角度和不同焦距下的圖像。

4、圖像處理

獲得的電子顯微鏡圖像通常是模糊且包含噪聲的。因此，需要對圖像進行處理，以獲得更清晰、更準確的結構信息。圖像處理的主要步驟包括去噪、增強對比度、對齊和三維重建等。通過這些處理步驟，可以獲得高分辨率的三維結構模型。

5、結果分析

需要對獲得的結構模型進行分析和解釋。可以使用分子建模軟件將蛋白質或其他生物分子的原子坐標與結構模型進行比較，以驗證模型的準確性。此外，還可以使用其他生物物理學和生物化學技術對結構進行進一步的驗證和研究。

冷凍電鏡優勢及技術難點

1、冷凍電鏡的優勢

（1）樣品需求量少

與其他結構生物學研究方法相比，冷凍電子顯微學對樣品的需求量非常少。以單顆粒重構技術為例: 對于生化性質及構象均一性很好的樣品，只要幾萬至十幾萬個分子的圖像，即有可能獲得近原子分辨率的三維結構；對于具有高度對稱性的病毒等大分子復合物，甚至只要幾千個顆粒的圖像即可達到原子分辨率1。實際操作中，一個冷凍樣品只需要 3~5 µL 0.1~1 µmol的蛋白質溶液。這與X射線晶體學和核磁共振波譜學對樣品量的大量需求形成了鮮明的對比。

（2）更接近生理狀態

冷凍電子顯微學通過將樣品快速冷卻（冷卻速度可達每秒10萬度）至玻璃態冰達到固定生物含水樣品的目的，其觀察的結構信息基本上反映樣品冷卻前 的瞬時狀態。因為冷凍電鏡的樣品制備不需要結晶，而是直接對生物樣品的溶液狀態或細胞內狀態進行冷凍制樣分析，因此是更接近樣品生理狀態的一種結構生物學研究手段。

（3）適用研究對象廣泛

冷凍電子顯微學可以觀察的樣品尺度范圍相當廣泛。從細胞、細胞器到分子量在 500 kD 以上的大分子復合體，均是冷凍電子顯微學的傳統研究對象。最近幾年來，隨著冷凍電子顯微鏡的硬件技術尤其是圖像采集設備的迅速發展，冷凍電子顯微學已經可以對 200 kD 以上的蛋白質結構進行高分辨率解析并在繼續突破更小的分子量下限。

（4）可以對不均一樣品進行研究

與其他結構生物學手段相比，冷凍電子顯微學的一個獨特優勢是直接獲取放大幾萬倍至十幾萬倍的樣品微觀圖像，并通過對多個分子圖像的統計學分析獲得結構信息。這種統計分析的過程可以將樣品中可能存在的多種分子結構分類，從而將組成不同、構象不同的分子區分開來。目前在實踐中使用的多種針對分子結構進行二維和三維分類的算法已經相對比較成熟，從而使得對均一性較差樣品的高分辨率結構解析變得可能2。更重要的是，對大量單分子結構的分類使我們除了獲得這些不同類別的分子結構外，還獲得了這些不同分子結構在樣品中的統 計分布。對不同溫度、不同溶液和不同生化反應時間點的這種結構異質性的統計分析，將使我們獲得與結構信息相關聯的生物大分子復合體熱力學及動力學的重要信息，從而更深入地揭示其分子機制3。

2、冷凍電鏡的技術難點及未來發展的趨勢4

與其他的結構生物學和生物物理學研究方法類似，冷凍電子顯微學在硬件設備上的長足進展解決了很多關鍵性的技術難點，使該方法的應用普及成為趨勢。同時，一些其他的技術難點凸顯出來，成為結構解析中的瓶頸。

（1）樣品制備技術

樣品制備一直是冷凍電子顯微學研究的關鍵步驟。對于生物大分子結構研究來說，需要保證單顆粒分子以合適的密度均勻分布于厚度合適的無序冰中，才有可能獲得良好的電子顯微數據進行結構解析。由于不同的生物大分子與樣品支持膜的相互作用及在水溶液中的性質各不相同，分子在樣品中的分布狀態各異。目前普遍采用的冷凍制樣技術在基本原理上仍然采用 30 年前發明的方法，實驗可重復性、操作可移植性、通用性等都很差。樣品制備已經成為冷凍電子顯微學結構解析的限速步驟。冷凍電子顯微學要想成為結構生物學研究的主要應用手段，必須在樣品制備這一步驟取得重要的突破。類似的，對于細胞結構研究來說，將本身很厚的細胞樣品進行減薄處理，才適合冷凍電鏡觀察。

（2）高分辨率結構的分析與建模

應用冷凍電子顯微學技術在過去的兩年里所獲得的近原子分辨率(4 Å 以上)三維結構的數目幾乎超過了前面幾十年所獲得的高分辨率結構數目之和。更多的在 4~8 Å 分辨率范圍內的結構在很短時間內被解析出來。不同的分辨率結構可以揭示出的結構細節亦不同。而與晶體學手段不同，冷凍電子顯微學單顆粒重構無法通過對晶格衍射點的信號強弱來判斷分辨率，因此如何客觀地對三維重構的結果進行檢驗、明確結構解析的分辨率是目前高分辨率冷凍電鏡研究中的一個重要問題。在此基礎上，需要對不同分辨率水平的三維重構進行原子模型的構建，從而實現在原子水平上對分子功能的解釋。對于分辨率在 4 Å 以上的三維重構基本可以應用 X 射線晶體學現有的方法進行建模；對分辨率在 4 Å 以下的三維結構如何建立較為可信的模型，則仍缺少相對成熟并被普遍接受的方法。

（3）生物大分子構象不均一性的分析

冷凍電子顯微學單顆粒結構解析技術與晶體學技術的一個重要差異是不需要溶液中的生物大分子形成高度有序的晶體排列，因而可以直接獲得溶液中的生物大分子結構。但生物大分子尤其是大分子復合體本身的構象柔性亦因此沒有被固定在晶體結構中，這些構象柔性反映在電子顯微圖像中，常常是導致三維重構無法獲得高分辨率結構的根源，將不同構象的分子分開分析是提高重構分辨率的重要過程。此外，分子在溶液中的不同構象很可能反映了分子發揮功能的不同結構形態，理解這些構象差異對于解釋分子功能的機制非常重要。目前對生物大分子構象不均一性的分析是冷凍電子顯微學結構解析中的技術難點和熱點。

（4）電子光學新技術方法在生物樣品研究中的應用

材料科學超高分辨率研究在過去十幾年里也發生了很多重要的技術進步，主要是電子顯微鏡光學系統的不斷完善和提高，以及新的成像手段的進步。新的技術諸如球差矯正、色差矯正、掃描透射電子顯微鏡系統等都在材料科學領域結構分辨率的顯著提高中發揮了重要作用。目前，利用最新的電子光學成像系統，物理學和材料科學研究者已經可以獲得0.5Å的分辨率。隨著對生物樣品近原子分辨率結構解析能力的逐漸普及，更高的分辨率必然成為冷凍電子顯微學發展的下一個目標。如何應用材料科學領域證明對超高分辨成像卓有成效的電子顯微學方法來提高生物樣品的結構解析分辨率，是擺在所有冷凍電子顯微學家面前的新機遇和挑戰。

資料來源：

[1] Zhang X, Ge P, Yu X, et al. Cryo-EM structure of the mature dengue virus at 3.5-Å resolution. Nat Struct Mol Biol, 2013, 20: 105–110

[2]Fernandez I S, Bai X C, Hussain T, et al. Molecular architecture of a eukaryotic translational initiation complex. Science, 2013, 342: 1240585

[3]Liu J J, Bratkowski M A, Liu X, et al. Visualization of distinct substrate-recruitment pathways in the yeast exosome by EM. Nat Struct Mol Biol, 2014, 21: 95–102

[4]王宏偉.冷凍電子顯微學在結構生物學研究中的現狀與展望[J].中國科學：生命科學, 2014, 44(10):9.DOI:10.1360/052014-140.