冷凍透射電鏡

冷凍透射電鏡（Cryo-Transmission Electron Microscopy，Cryo-TEM）技術一般是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍裝置，將樣品冷卻到液氮溫度（77 K）來觀測某些對溫度敏感的樣品（如蛋白、生物切片等）的一種技術。冷凍透射電鏡的核心原理是利用冷凍技術將生物樣品迅速固定在電鏡載網(wǎng)上，保持樣品在顯微觀察過程中的原始狀態(tài)，由于冷凍過程中樣品內(nèi)部的水分瞬間凝固，使得樣品中的生物大分子和細胞結構得到很好的保持。此外，冷凍過程中樣品表面的脂質(zhì)層也被凍結，避免了樣品在觀察過程中的干燥和變形，簡言之就是通過對樣品的冷凍，降低電子束對樣品的損傷，減小樣品的形變，從而得到更加真實的樣品形貌。

冷凍透射電鏡的優(yōu)勢：

①保持樣品的原貌

傳統(tǒng)的透射電鏡在觀察生物樣品時，需要使用戊二醛等固定劑對樣品進行處理。這種處理方法可能會導致樣品中的生物大分子結構發(fā)生改變，從而影響到觀察結果的準確性。而冷凍透射電鏡則可以直接將樣品固定在載網(wǎng)上，無需額外的固定處理，有效保持了樣品的原貌。

②提高圖像質(zhì)量

冷凍透射電鏡通過冷凍樣品，使樣品內(nèi)部的結構保持在納米級別的原始狀態(tài)。這樣，我們在觀察樣品時可以得到更高分辨率的圖像，甚至能夠觀察到一些傳統(tǒng)透射電鏡無法分辨的細節(jié)。此外，冷凍透射電鏡還可以通過調(diào)整電子束的強度和聚焦，進一步提高圖像的質(zhì)量。

③簡化樣品制備過程

傳統(tǒng)的透射電鏡樣品制備過程復雜，需要經(jīng)過固定、切片、染色等多個步驟。這些步驟不僅費時費力，而且容易引入人為誤差。冷凍透射電鏡則可以直接將樣品固定在載網(wǎng)上，省去了繁瑣的制備過程，降低了樣品的制備難度。

④適用于各種生物樣品

冷凍透射電鏡可以用于觀察各種生物樣品，包括細胞、病毒、蛋白質(zhì)等。無論是干燥樣品還是濕潤樣品，冷凍透射電鏡都能夠輕松應對。這使得冷凍透射電鏡在生物研究領域具有廣泛的應用前景。

冷凍掃描電鏡

冷凍掃描電鏡(Cryo-scanning electron microscope，Cryo-SEM)基于掃描電鏡的超低溫冷凍制樣及傳輸技術發(fā)展而來，無需對樣品進行干燥處理，可直接觀察液體、半液體樣品，最大程度地減少了常規(guī)掃描電鏡樣品制備中的干燥過程對高度含水樣品的不利影響，是國內(nèi)外較為重視的一種電鏡技術發(fā)展趨勢。與同樣可以觀察含水樣品的環(huán)境掃描電鏡(environmental scanning electron microscope，ESEM)相比，冷凍掃描電鏡具有能在高真空狀態(tài)下觀察含水樣品、分辨率較高、可對樣品進行斷裂刻蝕等優(yōu)點【附表：冷凍掃描電鏡與常規(guī)掃描電鏡和環(huán)境掃描電鏡的比較（因本行研重點介紹冷凍電鏡，所以對常規(guī)掃描電鏡和環(huán)境掃描電鏡只做簡單比較）】。

表. 冷凍掃描電鏡與常規(guī)掃描電鏡和環(huán)境掃描電鏡的比較

冷凍掃描電鏡的關鍵是超低溫冷凍制樣及傳輸技術，常規(guī)掃描電鏡上可以通過加載低溫冷凍制備傳輸系統(tǒng)和冷凍樣品臺來改造升級為冷凍掃描電鏡。超低溫快速冷凍制樣技術可使水在低溫狀態(tài)下呈玻璃態(tài)，以減少冰晶的產(chǎn)生，從而不影響樣品本身結構；冷凍傳輸系統(tǒng)則保證在低溫狀態(tài)下將樣品轉移至電鏡腔室并進行觀察。其制樣過程簡單快速，無需對樣品進行脫水、干燥，也無需使用鋨酸等有毒試劑，只需利用超低溫快速冷凍完成樣品的固態(tài)化后，通過冷凍傳輸系統(tǒng)在低溫狀態(tài)下將樣品轉移至電鏡樣品艙中的冷臺（溫度可達185℃）上即可觀察。此外，冷凍掃描電鏡樣品制備艙的冷凍臺上配有冷刀（切斷樣品進行內(nèi)部觀察用）、加熱器（升溫除霜用）和噴鍍裝置，可簡單快速地對預冷過的樣品進行斷裂、升華、鍍金，暴露其內(nèi)部結構以供觀察。

冷凍掃描電鏡的工作流程如下圖所示：

①將樣品用冷凍膠水固定于樣品托上；

②將樣品插入溫度低于130K(-143．15℃)的過冷液氮雪泥中快速冷凍固定，在低于130K時，水分子的移動性非常慢以至于不能形成有害的冰晶；

③在真空條件下，將樣品轉移到安裝在掃描電鏡樣品艙端口上的制樣艙中的冷臺上，根據(jù)需要進行冷凍斷裂、冷凍升華刻蝕和濺射鍍膜等處理；

④在真空條件下，將樣品轉移至掃描電鏡樣品艙中的冷臺上進行超微結構觀察。

圖. 冷凍掃描電鏡工作流程

3、冷凍蝕刻電鏡

冷凍蝕刻（Freeze-etching）技術也叫冷凍斷裂（Freezer-fracturing）或冷凍復型（Freeze-replica）技術，是生物材料電鏡樣品制備的常規(guī)方法之一。冷凍刻蝕技術的基本步驟是：首先將樣品在冷凍劑中急速冷凍，然后在真空中切斷，在切斷后的斷面上有細胞器，其間還有凍成冰的水分，稍加熱使冰升華(水分揮發(fā))，使細胞器的膜結構暴露出來，斷面變得凹凸不平，好像“雕刻"一樣，故稱為冷凍刻蝕，如圖所示。最后在真空中向斷面噴鍍鉑一碳投影，再噴碳加固，這樣，在斷面形成一層復型膜，這層膜復印了細胞斷面的立體結構。把復型膜下的組織腐蝕掉后，剩下的復型膜就是冷凍刻絀的電鏡樣品，它能很好地描述膜的主體結構。

圖. 通過冷凍蝕刻技術得到的細胞表面

采用冷凍蝕刻技術制備的樣品與通常的超薄切片樣品相比較，其主要特點是：

??①由于省去了超薄切片制樣過程中強烈的化學固定、脫水、滲透、色埋以及染色的步票，因而避免了上述步驟中可能對細胞超微結構引人的一些人為假象，也就是說，采用冷凍蝕刻技術制備的樣品有可能得到更近似于活體狀態(tài)下的細胞圖象；

??②超薄切片給出細胞的平面圖象，而冷凍蝕刻則得到浮雕似的細胞圖象。因此，從冷凍蝕刻樣品中可以更加形象地了解細胞與細胞之間，或同一細胞中各種細胞器之間的相互位置關系；同時，細胞若經(jīng)特處理后再制成冷凍蝕刻樣品，還能夠請晰地看到由各種粗細不同的纖維構成的細胞骨架網(wǎng)結構；

??③采用冷凍蝕刻技術可以直接看到細胞內(nèi)生物膜（細胞質(zhì)膜、核膜、線粒體膜和葉綠體片忌您）疏水區(qū)兩個面上結構，諸如膜蛋白、核膜孔和細胞連接裝置的形狀、分布、密度等。

4、小結

冷凍透射電鏡（Cryo-TEM）、冷凍掃描電鏡（Cryo-SEM）和冷凍蝕刻電鏡這三種技術都利用了冷凍技術來保持生物樣品的自然狀態(tài)，但它們在樣品制備、成像原理和應用方面等方面各有側重，如下表所示。每種技術的選擇取決于研究目的和所需觀察的樣品特性。

資料來源：

[1] 資料來源：測試狗科研服務

[2] 張曉凱,張叢叢,劉忠民,劉力嘉,夏蕾.冷凍電鏡技術的應用與發(fā)展[J].科學技術與工程,2019,19(24):9-17

[3] 肖媛,李婷婷,周芳,左艷霞.冷凍掃描電鏡及其在生命科學研究中的應用[J].電子顯微學報,2015,34(5):447-451

[4] 張景強．生物電子顯微技術．中山大學出版社．1987

[5] 圖片來源：百度百科

[6] 魯崎唔.冷凍蝕刻技術及儀器[J].國外科學儀器,1990(4):38-4146