摘 要： 優(yōu)化了蝦蛄生物可給性鎘檢測方法的樣品處理條件。運用簡單的生物可給性提取技術(shù)，參照《中國藥典》藥物溶出度與釋放度、崩解時限檢查法，結(jié)合膳食攝入水平，以蝦蛄為研究對象，探討了料液比、模擬人工胃液pH值、消化時間等參數(shù)對檢測結(jié)果的影響，采用響應(yīng)面法對蝦蛄生物可給性鎘的最佳消化條件進行了優(yōu)化，建立了相應(yīng)的檢測模型。結(jié)果表明，料液比為0.5 g/mL，人工胃液pH值調(diào)至1.1，消化時間2 h，消化溫度為（37±1） ℃時，生物可給性鎘檢測效率最高。優(yōu)化后的蝦蛄生物可給性鎘檢測方法為實現(xiàn)重金屬人體生物可給性實驗方法的標準化提供了一種解決方案。

關(guān)鍵詞： 蝦蛄； 鎘； 生物可給性； 人工胃液

 

蝦蛄，別稱口蝦蛄、皮皮蝦、蝦爬子等，是一種多年生大型底棲甲殼類動物，因其營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美而深受人們喜愛。近幾年，蝦蛄中頻繁檢出鎘(Cd)，引起人們對其食用安全的擔(dān)憂。鎘是一種在生命系統(tǒng)中積累的有毒重金屬，具有一定的致癌和致突變性，易通過食物鏈進入人體并造成嚴重危害[1?2]。鎘在生物體內(nèi)的半衰期長達10～30年，是已知的最易在生物體內(nèi)蓄積的污染物之一[3]。

鎘在生物體內(nèi)有多種存在形式，包括可溶性的無機鎘、有機鎘和不溶性的礦物鹽類鎘等。由于不同形態(tài)的鎘沒有統(tǒng)一規(guī)范的檢測方法，目前食品安全國家標準均以總鎘含量作為檢驗和判定指標。然而，食物中的鎘被人體攝入后，首先要經(jīng)口腔胃腸液消化溶出(這部分鎘稱為生物可給性鎘)，然后才能穿過腸壁進入體循環(huán)產(chǎn)生危害(這部分鎘稱為生物有效性鎘)。食物中的總鎘并不能完全被人體吸收。因此以總鎘含量評估食品中鎘的毒性往往會放大鎘的毒性效應(yīng)，以生物可給性鎘和生物有效性鎘作為評價指標可以實現(xiàn)更準確的風(fēng)險評估。筆者探討了一種基于人體生理特點的蝦蛄最大生物可給性鎘的檢測方法，以實現(xiàn)對蝦蛄中鎘的更準確的風(fēng)險評估。

檢測食品中重金屬生物可給性的常用方法是體外消化模擬實驗[4]。徐笠等[5]對幾十年來體外消化法研究進行梳理總結(jié)出目前主要有8種源于國外的體外消化方法，分別是PBET法、RIVM法、TIM法、DIN法、SBET法、IVG法、SHINE法、UBM法。這些方法模擬的器官包括口腔、胃、小腸、大腸等，考慮了不同pH、料液比、不同成分消化液、不同停留時間、不同消化環(huán)境以及不同空腹和飽腹狀態(tài)等因素，每一種方法均有其理論基礎(chǔ)和應(yīng)用范圍。李娜等[6]發(fā)現(xiàn)不同模型對不同重金屬元素的生物可給性的結(jié)果也有差異。目前，體外消化方法類型的選擇和設(shè)計主要取決于研究者的研究目的和意圖，尚無規(guī)范統(tǒng)一的重金屬生物可給性檢驗方法。這8種體外消化方法中，SBET法屬于簡單生物可給性提取法，只考慮胃消化作用。由于胃液極低的pH值可以最大程度地溶出重金屬，更適用于風(fēng)險評估結(jié)果，因此該方法被英國地質(zhì)調(diào)查局[7]和美國環(huán)保局采納用于土壤重金屬的風(fēng)險評估[8]。

筆者參考側(cè)重于風(fēng)險評估的簡單生物可給性提取法(SBET)，用符合人體生理特點的鹽酸人工胃液替代該方法模擬胃液中添加的非人體內(nèi)環(huán)境常規(guī)成分氨基乙酸。考慮到人體攝入食品和藥品后有相同的代謝環(huán)境，借鑒《中華人民共和國藥典(2020年版)》(以下簡稱為《中國藥典》)中關(guān)于藥品溶出度與釋放度、崩解時限等分析方法[9]，結(jié)合食品攝入習(xí)慣，對消化時間、pH值、振蕩頻率、料液比進行單因素試驗和響應(yīng)面試驗，得出最佳優(yōu)化后的胃液消化提取條件，探討了一種借鑒《中國藥典》和SBET提取法，經(jīng)優(yōu)化后進行蝦蛄最大生物可給性鎘的檢測方法。

 

1、 實驗部分

 

1.1 主要儀器和試劑

原子吸收分光光度計：ICE 3500型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

微波消解儀：TOPEX型，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司。

高速冷凍離心機：ST 16R型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

數(shù)顯恒溫水浴振蕩：HH-4型，精度為±1 ℃，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

高速分散器：T 18型，德國IKA公司。

電子天平：QUINTIX124-1CN型，感量為0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

鎘標準溶液：1 000 μg/mL，標準物質(zhì)編號為GBW08612，中國計量科學(xué)研究院。

蝦中鎘質(zhì)控樣品：編號為P99856B，鎘質(zhì)量分數(shù)為（0.110±0.025） mg/kg，廣州譜恩科學(xué)儀器有限公司。

磷酸二氫銨：分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

硝酸：電子UP級，成都市科隆化學(xué)品有限公司。

鹽酸：優(yōu)級純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

胃蛋白酶：豬胃粘膜，UPS級，活性為1∶3 000，上海博湖生物科技有限公司。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 微波消解條件

微波功率：1 800 W；升溫程序：80 ℃，保持時間3 min；100 ℃，保持時間2 min；120 ℃，保持時間3 min；150 ℃，保持時間3 min；180 ℃，保持時間3 min；200 ℃，保持時間30 min。

1.2.2 石墨爐工作條件

石墨管：涂層石墨管；校正背景：塞曼；檢測波長：228.8 nm；燈電流：4 mA；通帶：0.5 nm；氬氣流量：0.2 L/min；升溫程序：以10 ℃/s升溫至100 ℃，保持30 s；以150 ℃/s升溫至800 ℃，保持20 s；升溫至1 400 ℃，保持3 s后停氣檢測；2 500 ℃，保持3 s。

1.3 溶液制備

稀鹽酸：按《中國藥典》規(guī)定方法配制，取鹽酸234 mL，加水稀釋至1 000 mL，即得。HCl體積分數(shù)為9.5%～10.5%。

鹽酸人工胃液：按《中國藥典》0 921附注，取稀鹽酸16.4 mL，加水約800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋成1 000 mL，根據(jù)需要調(diào)整pH值。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品處理

分別從4個市地的10家農(nóng)貿(mào)市場及漁市碼頭隨機采集海捕野生蝦蛄樣品，去掉頭部，手工剝?nèi)ネ鈿ぃ〖∪饨M織勻漿，于-18 ℃下冷凍，備用。

1.4.2 總鎘實驗方法

稱取1.4.1勻漿液1.0 g (精確至0.000 1 g)，加入8 mL硝酸，在1.2.1儀器工作條件下進行微波消解，趕酸后用1%(體積分數(shù)，下同)硝酸溶液定容至20 mL，為樣品消化液。按1.2.2設(shè)定石墨爐工作參數(shù)，其他按照GB 5009.15—2014《食品安全國家標準　食品中鎘的測定》進行，測定并計算總鎘含量。同時做空白和實物質(zhì)控樣品。每個樣品進行3次測定。

1.4.3 生物可給性鎘實驗方法

稱取1.4.1解凍后混勻的蝦蛄勻漿液1.0 g(精確至0.000 1 g)，置于15 mL離心管中。加入2.00 mL鹽酸人工胃液(料液比為0.5 g/mL)，置于（37±1） ℃水浴中，振蕩頻率為100 次/min，消化2 h，取出冷卻至室溫，定容至10 mL。再將其置于提前預(yù)冷的4 ℃冷凍離心機中，以10 000 r/min離心20 min。取上清液1 mL，按1.4.2進行實驗，檢測生物可給性鎘。同時做空白和實物質(zhì)控樣品。每個樣品平行測定3次。

1.4.4 單因素試驗

通過單因素試驗，主要研究料液比、pH值、消化時間和振蕩頻率4個因素對生物可給性鎘含量影響。

1.4.5 響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的前提下，使用Design-Expert 13.0軟件進行響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面水平因素表見表1，研究A (消化時間)、B (pH)和C (料液比)3個因素對生物可給性鎘含量的影響。

表1   響應(yīng)面水平因素表

Tab. 1   Table of response surface level factors

 

 

 

2、 結(jié)果與討論

 

2.1 單因素試驗參數(shù)優(yōu)化

結(jié)合《中國藥典》中影響藥物溶出度和釋放度及崩解時限的參數(shù)，并考慮成人每餐食物攝入量400～700 g[10]，每日攝入飲用水1 500 mL，胃液每日分泌1 000～2 500 mL[11]，研究消化時間(0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 h)、振蕩頻率[30、50、70、90、110、130、150次/min (往復(fù)振蕩)]、pH (1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)、料液比(4.00、3.00、2.00、1.00、0.50、0.33、0.25 g/mL)4個因素對生物可給性鎘含量的影響，結(jié)果如圖1所示。

 

圖1   各因素對生物可給性鎘含量的影響

Fig. 1   Influence of various factors on cadmium bioaccessibility content

 

從圖1中可以看出，隨著消化時間延長，鎘溶出的含量逐漸上升并趨于平衡，在達到3 h時后逐漸平穩(wěn)，因此選擇消化時間2、3、4 h進行響應(yīng)面試驗。振蕩頻率對鎘含量結(jié)果基本無影響，因此忽略此因素。pH值越大，鎘的溶出越低，pH在1.0時生物可給性鎘含量最高，結(jié)合人體實際情況，選擇pH值1.0、1.5、2.0進行響應(yīng)面試驗。料液比在2.0 g/mL之后，鎘的溶出值增加，在0.5 g/mL之后逐漸平穩(wěn)，因此選擇料液比2.0、1.0和0.5 g/mL進行響應(yīng)面試驗。

2.2 響應(yīng)面法試驗參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計響應(yīng)面實驗，單因素試驗結(jié)果表明，振蕩頻率對鎘溶出沒有影響，選擇消化時間、料液比、pH值進行3因素3水平響應(yīng)面試驗。料液比2.0、1.0、0.5 g/mL，分別用用料含量0.667%、0.500%、0.333%代替。響應(yīng)面試驗設(shè)計分析表見表2。

表2   響應(yīng)面試驗設(shè)計分析表

Tab. 2   Response surface experiment design analysis table

注：料液比2.0、1.0、0.5 g/mL，分別用用料質(zhì)量分數(shù)0.667%、0.500%、0.333%代替。

 

對表2的數(shù)據(jù)進行擬合，得到的生物可給性鎘含量模型方程見式（1）。

 

（1）

該模型方程的回歸分析和變異系數(shù)分析見表3。由表3可知，該試驗的模型P值小于0.01，說明該模型達到極顯著水平；失擬項的P值為0.521 9，說明失擬項不顯著，擬合方程可以達到目的。因素B的P值小于0.01，說明消化液pH對鎘含量的影響極顯著，因素C用料含量P小于0.05，說明料液比對鎘含量也有顯著的影響，而消化時間影響則不顯著。通過比較分析，在影響生物可給性鎘含量的因素中，其影響因素從大到小順序依次為消化液pH、料液比、消化時間。

表3   回歸模型分析表

Tab. 3   Regression model analysis table

注：1）A—消化時間，B—消化液pH，C—用料含量：2）P＜0.01極顯著差異，標注為**；P＜0.05顯著差異，標注為*。

 

經(jīng)統(tǒng)計分析，該模型決定系數(shù)R2為0.918 5，說明該模型能解釋91.85%的響應(yīng)結(jié)果變化，其擬合度良好，誤差小，能較好地分析預(yù)測生物可給性鎘含量；變異系數(shù)CV為9.84%，小于10%，說明此研究具有較高的可信度和精確度；該模型精密度結(jié)果為9.471 8，大于4，說明該模型可預(yù)測，因此該模型對生物可給性鎘適應(yīng)性較好。

2.2.2 交互因子效應(yīng)分析

根據(jù)所得的回歸方程分析2個因素之間的交互影響，得到交互因子的響應(yīng)面和等高線圖，如圖2～圖4所示。響應(yīng)面的陡度或平緩度可以反映出試驗條件變化對響應(yīng)值的影響，等高線形狀可以反映相互作用強度，等高線呈橢圓形，則2個因素之間相互作用強烈；圓形則表明2因素之間交互作用較弱；等高線排列越緊密，表明對試驗結(jié)果影響越大。從圖2～圖4中可以看出，所有響應(yīng)面圖都呈現(xiàn)良好的拋物線形狀，表明各因素都有明顯的相互作用，且每個曲面圖的開口都向下，證明試驗結(jié)果具有最大值。因此各因素水平范圍內(nèi)可以確定最優(yōu)的參數(shù)組合。

圖2   消化時間和pH對生物可給性鎘含量的影響

Fig. 2   Effect of digestion time and pH on cadmium bioaccessibility levels

 

 

圖3   消化時間和料液比對生物可給性鎘含量的影響

Fig. 3   Effect of digestion time and material-liquid ratio on cadmium bioaccessibility content

 

 

圖4   pH和料液比對生物可給性鎘含量的影響

Fig. 4   Effect of pH and material-liquid ratio on cadmium bioaccessibility content

 

2.2.3 響應(yīng)面法最佳參數(shù)驗證和結(jié)果質(zhì)控

試驗采用Design-expert13.0軟件進行優(yōu)化，最終優(yōu)化參數(shù)為消化時間2.018 h，pH值1.100，用料含量為0.345%，生物可給性鎘含量最佳響應(yīng)預(yù)測結(jié)果為4.392 mg/kg，根據(jù)實際情況，調(diào)整參數(shù)為消化時間2 h，pH值1.1，料液比0.5 g/mL，實際檢測值為4.452 mg/kg，與預(yù)測值相差0.06 mg/kg，說明該模型誤差小。按照該模型對28個蝦蛄樣品進行生物可給性鎘檢測，蝦蛄鎘的生物可給率為26.4%～78.6%。已有研究表明，貝類、縊蟶、蛤仔、鮑魚、牡蠣、小龍蝦的生物可給性鎘在28.6%～87.7%之間[12?17]，兩者數(shù)據(jù)接近，表明本研究模型具有可行性。

按1.4.2操作，蝦蛄質(zhì)控樣鎘檢測結(jié)果為0.114 mg/kg，符合質(zhì)控樣品要求(0.085～0.135 mg/kg)；所有試驗3次測定結(jié)果的相對標準偏差為0.8%～7.2%(n=3)，均小于10%；空白試驗結(jié)果均小于檢出限。表明該方法準確度較高。

2.3 生物可給性鎘檢測方法標準化可行性探討

經(jīng)優(yōu)化后得到的生物可給性鎘消化模型為：配制pH 1.1鹽酸人工胃液作為消化液，按照料液比0.5 g/mL，消化溫度（37±1） ℃，消化時間2 h，進行蝦蛄鎘溶出。該模型完全結(jié)合人體生理特點，簡單易行。該方法與現(xiàn)有研究采用的口腔胃腸液全仿生消化方法相比，胃液成分、pH值、料液比、消化時間更接近人體生理特點，節(jié)省了口腔腸道消化步驟。有研究表明，水產(chǎn)品鎘的溶出大部分在胃消化階段[18?19]。郝春莉等[20]研究了模擬胃、腸道消化液中類金屬硫蛋白(MT-like)對鎘的結(jié)合作用，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過腸道中性環(huán)境后，腸道MT-like蛋白能與胃液溶出的鎘大量結(jié)合，反而使暴露在體內(nèi)的生物可給性鎘降低。筆者所建方法經(jīng)優(yōu)化后可以最大程度地溶出鎘。其檢測數(shù)據(jù)可最大化鎘的生物可給性，為基于蝦蛄生物可給性鎘的膳食暴露風(fēng)險評估提供依據(jù)。

 

3、 結(jié)語

 

筆者結(jié)合《中國藥典》、中國居民膳食攝入水平和胃液分泌量，經(jīng)參數(shù)優(yōu)化后確定了料液比0.5 g/mL，pH值1.1人工胃液，消化時間2 h的蝦蛄中最大生物可給性鎘簡單消化模型，再按照GB 5009.15—2014《食品安全國家標準　食品中鎘的測定》對提取出的生物可給性鎘進行檢測，并對該模型方法進行了可行性驗證。該方法為食品中重金屬的生物可給性試驗方法的標準化研究提供了一種解決方案，為基于人體生物可給性的食品中重金屬的風(fēng)險評估提供了一種便捷途徑，為基于食品中重金屬生物可給性的風(fēng)險評估提供了一種理論依據(jù)。

 

參考文獻：

 

1 SATARUG S，BAKER J R，REILLY P E B，et al. Evidence for a synergistic interaction between cadmium and endotoxin toxicity and for nitric oxide and cadmium displacement of metals in the kidney［J］. Nitric Oxide-Biology and Chemistry，2000，4（4）：431.

 

2 ZHANG H，REYNOLDS M. Cadmium exposure in living orga-nisms：A short review［J］. Science of The Total Environment，2019，678：761.

 

3 SILVESTRE F，DIERICK JF，DUMONT V，et al. Differential protein expression profiles in anterior gills of Eriocheir sinensis during acclimation to cadmium［J］. Aquatic Toxicology，2006，76（1）：46.

 

4 付瑾，崔巖山.食物中營養(yǎng)物及污染物的生物可給性研究進展［J］.生態(tài)毒理學(xué)報，2011，6（2）：113.

    FU Jin，CUI Yanshan. Advances in bioaccessibility of nutrients and pollutants in food［J］. Asian Journal of Ecotoxicology，2011，6（2）：113.

 

5 徐笠，陸安祥，王紀華，等.食物中重金屬的生物可給性和生物有效性的研究方法和應(yīng)用進展［J］.生態(tài)毒理學(xué)報，2017，12（1）：89.

    XU Li，LU Anxiang，WANG Jihua，et al. Research methods and applications of bioaccessibility and bioavailability of heavy metals in food［J］. Asian Journal of Ecotoxicology，2017，12（1）：89.

 

6 李娜，耿照夢，郭瑩瑩，等.水產(chǎn)品中重金屬生物可給性與生物有效性研究進展［J］.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2022，13（5）：1 367.

    LI Na，GENG Zhaomeng，GUO Yingying，et al. Research progress of bioaccessibility and bioavailability of heavy metals in aquatic products［J］. Journal of Food Safety and Quality Testing，2022，13（5）：1 367.

 

7 OOMEN A G，HACK A，MINEKUS M，et al. Comparison of five invitro digestion models to studythe bioaccessibility of soilcon-taminants［J］.. Environ Sci Technol，2002，36（15）：3 326.

 

8 UK Environment Agency. International workshop on the potential use of bioaccessibility testing in risk assessment of land contamination（R］. RioHouse，Waterside Drive，Aztec West，Almondsbury，Bristol，BS324UD.2005

 

9 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2020年版）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：129.

    Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China 2020［M］. Beijing：China Medical Science Press，2020：129.

 

10 中國營養(yǎng)學(xué)會.中國居民膳食指南（2022）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2022.

    Chinese Nutrition Society. The Chinese dietary guidelines 2022［M］. Beijing：People's Medical Publishing House，2022.

 

11 陳勝良.關(guān)注胃腸道消化吸收效率照亮消化系統(tǒng)疾病治療領(lǐng)域的又一個學(xué)術(shù)盲區(qū)［M］.北京：中華醫(yī)學(xué)電子音像出版社，2017.

    CHEN Shenliang. Focusing on the efficiency of digestion and absorption in the gastrointestinal tract，illuminating another academic blind spot in the treatment of digestive disorders［M］. Beijing：Chinese Medical Multimedia Press，2017.

 

12 楊妙峰.體外仿生消化在華貴櫛孔扇貝（Chlamys nobilis）體內(nèi)鎘的生物可給性中的應(yīng)用［J］.漁業(yè)科學(xué)進展，2016，37（6）：94.

    YANG Miaofeng. Preliminary Application of in vitro bionics digestion model for bioaccessibility of Cd in chlamys nobilis［J］. Progress in Fishery Sciences，2016，37（6）：94.

 

13 洪雄業(yè).興化灣養(yǎng)殖貝類重金屬累積及健康風(fēng)險評價［J］.海峽科學(xué)，2014，92（8）：7.

    HONG Xiongye. Evaluation of heavy metal accumulation and health risk of farmed shellfish in Xinghua Bay［J］. Straits Science，2014，92（8）：7.

 

14 王增煥，王許諾，林欽，等.體外仿生法研究牡蠣和蛤仔體內(nèi)微量金屬元素的生物可給性［J］.分析化學(xué)，2016，44（2）：247.

    WANG Zenghuan，WANG Xunuo，LIN Qin，et al. Bioaccessibility of microamount metal elements in oyster and cam samples using in vitro digestion［J］. Chinese Journal of Analytical Chemistry，2016，44（2）：247.

 

15 蔡艷，周亦君，吳曉藝，等.3種海洋貝類重金屬污染及食用風(fēng)險評價研究［J］.核農(nóng)學(xué)報，2016，30（6）：1 126.

    CAI Yan，ZHOU Yijun，WU Xiaoyi，et al. Situation of heavy metal pollution and food risk assessment of 3 kinds of marine shellfish［J］. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2016，30（6）：1 126.

 

16 PENG Q，NUNES LM，GREENFIELD BK，et al. Are Chinese consumers at risk due to exposure to metals in crayfish？A bioaccessibility-adjusted probabilistic risk assessment［J］. Environment International，2016，88：261.

 

17 AMIARD JC，AMIARD-TRIQUET C，CHARBONNIER L，et al. Bioaccessibility of essential and non-essential metals in commercial shellfish from western Europe and Asia［J］. Food and Chemical Toxicology，2008，46（6）：2 010.

 

18 WANG Chao，DUAN HanYing，TENG JiuWei. Assessment of microwave cooking on the bioaccessibility of cadmium from various food matrices using an in vitro digestion model［J］. Biological Trace Element Research，2014，160（2）：276.

 

19 楊妙峰，鄭盛華，席英玉，等.應(yīng)用體外仿生消化法對華貴櫛孔扇貝體內(nèi)鎘進行生物可給率研究［J］.漁業(yè)研究，2019，41（5）：385.

    YANG Miaofeng，ZHENG Shenghua，XI Yingyu，et al. Bioaccessibility of cadmium in Chlamys nobills by in vitro bionics digestion model［J］. Fisheries Research，2019，41（5）：385.

 

20 郝春莉，黃婧筠，黃志勇.模擬胃腸道消化液中小球藻類金屬硫蛋白對鎘離子的結(jié)合作用研究［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2021，33（1）：62.

    HAO Chunli，HUANG Jingyun，HUANG Zhiyong. Binding effect of MT-like proteins from Chlorella sp. to Cd2+ in simulate gastrointestinal digestive juices［J］. Chemical Research and Application，2021，33（1）：62.