細(xì)菌內(nèi)毒素，進(jìn)入血液或腦脊液時(shí)會(huì)引起發(fā)熱，因此，又稱為“熱原”，它是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的特有結(jié)構(gòu)，細(xì)菌在存活狀態(tài)時(shí)不釋放出來(lái)，只有當(dāng)細(xì)菌死亡自溶時(shí)才釋放到細(xì)胞外，表現(xiàn)多種毒性作用，為區(qū)別于外毒素而稱之為內(nèi)毒素。細(xì)菌內(nèi)毒素作為外源性致熱原，極微量即可對(duì)人體健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響，能引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素血癥、內(nèi)毒素休克和彌散性血管內(nèi)凝血等，嚴(yán)重者會(huì)造成死亡。因此，對(duì)生物制品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)至關(guān)重要。

檢測(cè)方法

1、凝膠法

凝膠法是通過(guò)鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理進(jìn)行半定量檢測(cè)內(nèi)毒素的方法。此檢測(cè)方法雖為內(nèi)毒素檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，但檢測(cè)范圍存在一定的局限性，且對(duì)檢測(cè)用水和檢測(cè)條件均存在一定的要求。

2、光度測(cè)量法

光度法（包括濁度法和顯色法）可定量檢測(cè)內(nèi)毒素的含量，其中濁度法是通過(guò)內(nèi)毒素與鱟試劑的C因子產(chǎn)生反應(yīng)，由此激活的凝固酶會(huì)切斷凝固蛋白原中的精氨酸肽鏈，形成凝膠狀蛋白；而顯色基質(zhì)法是通過(guò)測(cè)定內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的凝固酶使某種特殊底物釋放出來(lái)的生色團(tuán)的量，來(lái)檢測(cè)內(nèi)毒素含量的鱟試驗(yàn)法。

定量檢測(cè)的數(shù)據(jù)不僅有利于追蹤產(chǎn)品質(zhì)量趨勢(shì)，還能起到風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警的作用，達(dá)到數(shù)據(jù)完整性的要求。

內(nèi)毒素檢測(cè)的影響因素

試驗(yàn)條件與操作：培養(yǎng)條件、操作環(huán)境可能引起各次實(shí)驗(yàn)之間、各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果差異。

1、時(shí)間

鱟試劑在液態(tài)時(shí)不穩(wěn)定，室溫放置太久會(huì)影響反應(yīng)靈敏度，加樣結(jié)束后，應(yīng)立即放入恒溫水浴中，延長(zhǎng)保溫時(shí)間，可提高LAL的靈敏度。5分鐘混合點(diǎn)的活性最強(qiáng)，混合時(shí)間越長(zhǎng)，活性反而降低，但在三十分鐘以內(nèi)的各混合時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的靈敏度均在規(guī)定范圍內(nèi)。在顯色法中靈敏度與時(shí)間有關(guān)，實(shí)驗(yàn)中既要嚴(yán)格控制每個(gè)環(huán)節(jié)的保溫時(shí)間，又要嚴(yán)格控制終止時(shí)間。

2、溫度

凝膠試驗(yàn)規(guī)定的孵化溫度為37℃，實(shí)驗(yàn)證明，保溫在25-41℃，隨著溫度的升高，LAL的靈敏度也隨著升高，在41-46℃之間，對(duì)靈敏度無(wú)明顯影響；≥48℃會(huì)破壞鱟試劑。

3、pH值

鱟試劑的pH作用區(qū)間是6-8之間，7.0-7.5最佳。

4、試驗(yàn)耗材

內(nèi)毒素稀釋不宜用注射器，應(yīng)使用經(jīng)過(guò)校正的刻度吸管。且針?biāo)z塞容易吸附內(nèi)毒素而使其濃度不夠，造成凝膠反應(yīng)不成立。

5、操作程序

加樣次序可能會(huì)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不成立等問(wèn)題。

6、處理作用

不同產(chǎn)品處理和儲(chǔ)存條件可能為出現(xiàn)分析的誤差，鱟試劑溶解后的保存條件等。

供試品

1、多糖

β-葡聚糖可以激活G因子使得結(jié)果呈陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)室常用的酒精、棉球等含有較多的葡聚糖，低于一定濃度的葡聚糖或LAL-RM（反應(yīng)物）不足以使鱟試劑的凝集反應(yīng)產(chǎn)生陽(yáng)性，但如果有細(xì)菌內(nèi)毒素共同作用的情況下，凝集反應(yīng)會(huì)變得更為激烈和迅速，很容易使反應(yīng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。

2、蛋白

〖陽(yáng)離子蛋白〗：溶菌酶、核糖核酸酶A、以及人的免疫球蛋白G能夠與細(xì)菌內(nèi)毒素形成細(xì)菌內(nèi)毒素-蛋白復(fù)合體，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素有顯著的屏蔽作用，從而影響用鱟法來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素。在測(cè)定之前使用蛋白酶K來(lái)消化樣品，可使細(xì)菌內(nèi)毒素的回收率達(dá)到百分之百。

〖血紅蛋白〗：人血白蛋白、球蛋白、抗凝血酶Ⅲ均可以激活G因子。研究表明使用一般鱟試劑測(cè)定人血白蛋白、球蛋白等血液制品的陽(yáng)性檢出率明顯高于用去G因子LAL測(cè)定的陽(yáng)性率，而后者與兔熱原檢查結(jié)果基本一致。

〖免疫蛋白〗：免疫球蛋白可以激活G因子途徑。

3、離子

離子強(qiáng)度較大會(huì)引起內(nèi)毒素的聚集，加重低濃度內(nèi)毒素不易分散的問(wèn)題；另外LAL中的C因子必須在二價(jià)陽(yáng)離子的參與下才能被激活形成活化的C因子。研究發(fā)現(xiàn)鎂離子增強(qiáng)了LAL顯色反應(yīng)，鈣離子濃度大于5mmol/L時(shí)抑制反應(yīng)。當(dāng)溶液中含有EDTA等絡(luò)合劑或抗凝劑時(shí)，陽(yáng)性離子會(huì)失去作用，也就會(huì)影響測(cè)定。

4、有機(jī)鹽

核酸鈉能像內(nèi)毒素一樣被檢出，出現(xiàn)假陽(yáng)性干擾。

5、透析液

鱟試劑測(cè)定透析液中的內(nèi)毒素方法待進(jìn)一步考察。

6、中藥成分

清熱解毒類(lèi)藥物等能夠干擾LAL試驗(yàn)。

7、生化藥品

氨基酸對(duì)鱟試劑有較強(qiáng)的抑制作用。

8、其它物質(zhì)

多種凝血因子、蛋白質(zhì)變性物質(zhì)、高糖溶液、絡(luò)合物、電解質(zhì)、維生素、添加劑等都會(huì)干擾鱟試劑形成凝膠。

9、鱟試劑內(nèi)源性因子

試劑盒內(nèi)部因子干擾。

10、試劑質(zhì)量

批次、溶解水、靈敏度等。

檢測(cè)趨勢(shì)

隨著鱟資源的逐漸減少和重組技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外出現(xiàn)了幾種新興的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法，主要有兩種：

1、微量凝膠法或微量顯色法，仍然采用鱟試劑，但用量?jī)H為原來(lái)的八分之一或更少。

2、重組C因子法。重組C因子是一種人工合成的C因子，它可被細(xì)菌內(nèi)毒素活化后，與熒光底物作用產(chǎn)生于內(nèi)毒素濃度呈量化關(guān)系的熒光信號(hào)。

生物制品中內(nèi)毒素的來(lái)源主要有：菌毒種、生產(chǎn)環(huán)境、不規(guī)范操作、設(shè)備及器械、原輔材料等。對(duì)于生物制品生產(chǎn)中內(nèi)毒素污染的控制最主要的措施是生產(chǎn)過(guò)程控制，即嚴(yán)格按GMP要求進(jìn)行生產(chǎn)，嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止內(nèi)毒素產(chǎn)生。