細菌內毒檢查法作為控制藥品質量的一種常規、經濟、有效方法，但是，在為新化合物或者新藥建立細菌內毒素檢查方法時，常常會遇到各種各樣的困難，尤其是尚處在新藥研發早期階段的藥物，由于藥物制劑、賦性劑等不穩定給方法的建立帶來不同程度的影響。

近日在對比審核新版ChP內容，特將兩版《中國藥典》1143細菌內毒素檢查法進行對比:

根據上表對比分析，2025版《中國藥典》對細菌內毒素檢測法的核心內容、操作要點等內容無修訂，說明目前內毒素檢測法對于現在市場或技術是滿足的；在光度檢測技術內容上無任何修改，也側面說明目前該方法技術驅動不強或方法革新無任何推動。該次主要修訂在內毒素限值、鱟試劑靈敏度復核試驗有效性和細化檢測方法等方面完善。因此該次2025版ChP修改對企業或者市場影響不大。

在藥典中明確規定供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗，當測定結果有爭議時，除另有規定外，以凝膠限度試驗結果為準。在此僅從一種新藥（X注射劑）的細菌內毒素方法建立及其檢測角色出發，在此淺談細菌內毒素檢查法-凝膠限度法。

 原理：通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理進行限度檢測或定量檢測內毒素的方法。

 方法建立工作需要系統化完成以下關鍵步驟，確保方法的科學性、合規性、可重復性。   

1.內毒素限值（L）的確認：一個藥品在投放市場前，它是否滿足內毒素限值要求？樣品內毒素含量具體是多少？這些問題不但關注用藥安全，還最大限度的提供有關內毒素含量的準確信息，為藥品生產中質量控制提供警戒信息，盡管內毒素檢查法的建立是一個科學方法的研究過程，但其最終目的還是要為控制藥品質量服務，因此，在方法建立時，不但要闡明限值的合理性，考慮技術可能達到的限值，同時還要滿足相關藥品管理法規的要求。

內毒素限值L的公式計算：L=K/M，舉例其中已知X注射劑的K=5EU/（kg.h），X注射劑的人體最大用量為每小時1.2g，按照我國人均體重60Kg計算，M=1.2g/h ÷60Kg=0.02g/kg.h=20mg/kg.h，即X注射劑內毒素限值L=K/M=0.25EU/mg，假定藥品X的濃度為100mg/ml，那么內毒素限值L=0.25EU/mg ×100mg/ml=25EU/ml。

2. 確定最大有效稀釋倍數（MVD）：MVD是指在所選擇的鱟試劑靈敏度條件下，對產品進行最大倍數的稀釋，仍能夠進行內毒素限值的檢測，此時所允許稀釋的最大倍數。計算公式：MVD=內毒素限值（L）×藥品濃度（C）÷鱟試劑靈敏度（λ），鱟試劑有多種規格，比如0.03EU/ml、0.06EU/ml、0.25EU/ml。根據上步確認L為0.25EU/mg，假定藥品X的濃度為10mg/ml，當選擇0.25EU/ml的鱟試劑，即MVD=10；當選擇0.03EU/ml的鱟試劑，MVD=83。

最小有效濃度（MVC）是指在所選擇的鱟試劑靈敏度條件下，將產品稀釋到一定濃度，仍能夠進行內毒素限值的檢測，此時所允許的最小濃度。MVC=鱟試劑靈敏度（λ）/內毒素限值（L）。

對選定的鱟試劑靈敏度來講，MVC時一個絕對值，MVD對特定的藥品濃度時特異的，濃度變化時，MVD也會隨之發生變化。

3. 供試品溶液的制備：確認藥品基本信息：藥品的分子量大小、規格、濃度、體積等，以便選擇合適的藥品處理方法和內毒素檢測方法。如果在處理過程中運用了激烈的處理條件或溶劑，還應證明采用方法不會破壞或者減少藥品中細菌內毒素含量，并且排除藥品pH、鹽濃度（推薦等滲環境）、溫度（一般不超過40℃）或β-葡聚糖等因素的干擾。

如何排除pH的干擾呢？假設藥品X的pH為3.90，一般而言供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的pH值在6.0-8.0的范圍內最為適宜。我們可以使用Tris緩沖液作為稀釋液，通過1M氫氧化鈉溶液來調節藥品的pH。當然1M氫氧化鈉和Tris緩沖液應該在已去除內毒素的容器中配制，且不含內毒素和干擾因子。

 4. 鱟試劑靈敏度復核試驗：選擇并確認鱟試劑使用規格，按照藥典或者廠家說明書要求制備細菌內毒標準品，然后制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ 4個濃度的內毒素標準液，取不同濃度的內毒素標準液分別與等體積的鱟試劑溶液（T）混合，每個內毒素濃度平行做4管，另取2管加入等體積的細菌內毒素檢查用水（BET）作陰性對照，根據下表進行加樣處理。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。

判斷方法  將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉180°，若管內形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫為陰性。

接受標準  當最低濃度管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。按下式計算反應終點濃度的集合平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（λc），

式中：X為反應終點濃度（指系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度）的對照值（lg）；n為每個濃度的平行管；

當λc在0.5λ-2λ（包括0.5λ、2λ）。方可用于細菌內毒素檢查，并以標示靈敏度為該批次鱟試劑的靈敏度。

 5. 方法學驗證試驗：

1） 預干擾實驗：預干擾試驗目的是初步確認最小不干擾的藥品稀釋濃度（NIC），為正式干擾試驗提供適當藥品稀釋濃度依據。預干擾試驗對一系列藥品X的稀釋液進行試驗，在每一個稀釋濃度都有一組添加內毒素的供試品溶液和一組不添加內毒素的供試品溶液，供試品濃度可逐級稀釋，但最終供試品的稀釋倍數不超過MVD。根據下表制備。

2） 干擾試驗：按照下表制備A、B、C、D，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過最大有效稀釋倍數（MVD）的溶液。

接受標準  只有當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管均為陰性，并且系列溶液C的結果復核鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，試驗方有效。

結果判斷  當系列溶液B的結果復核鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，認為在該濃度下的供試品溶液無干擾作用。其他情況則認為供試品在該濃度下存在干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。

 6. 凝膠限度試驗方法確認：撰寫方法學驗證試驗報告，并且對藥品X的細菌內毒素檢查完成日常檢測與質控的SOP，其內容一般包含樣品處理步驟、鱟試劑復溶方法、孵育時間、溫度控制、結果判斷標準等。具體加樣方式可參照下表來制備溶液A、B、C、D。其中使用稀釋倍數不超過MVD并且已經排除干擾的供試品溶液。

結果判斷  在37℃±1℃恒溫器中保溫60分鐘±2分鐘后觀察其結果（判斷方法與鱟試劑靈敏度復核試驗一致）。若陰性對照均為陰性，陽性對照管和供試品陽性對照管均為陽性，試驗方有效。若供試品兩個平行管均為陰性，則判斷供試品合格。若供試品兩個平行管均為陽性，則判定不符合規定。若供試品兩個平行管一管為陽性、一管為陰性，則需要進行復試。復試時供試品溶液C需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，則判定供試品符合規定，否則判定不符合規定。

參考文件：

1. 2020版《中國藥典》

2. 2025版《中國藥典》

3. [醫藥]細菌內毒素檢查方法的建立、限值的確定 - 豆丁網