嚴(yán)重?zé)齻麆?chuàng)面通常會破壞皮膚關(guān)鍵細(xì)胞的功能，導(dǎo)致再上皮化和創(chuàng)面再生延遲。促進(jìn)關(guān)鍵細(xì)胞的活動對燒傷創(chuàng)面修復(fù)至關(guān)重要。角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2(KGF-2)參與上皮細(xì)胞的增殖和重塑，酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)是成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞生長和分化的關(guān)鍵介質(zhì)。然而，燒傷創(chuàng)面較厚的焦痂和惡劣的環(huán)境往往會降低成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)向創(chuàng)面的遞送效率。

為解決以上問題，來自溫州醫(yī)科大學(xué)吳疆、李曉坤和肖健團(tuán)隊制備了一種新型的微針貼片，用于連續(xù)經(jīng)皮給藥KGF-2和aFGF，以增強(qiáng)燒傷創(chuàng)面治療效果。本文作者將包載有aFGF的NPaFGF 納米顆粒與KGF-2共同包裹在微針貼片(KGF-2/NPaFGF@MN)中實現(xiàn)經(jīng)皮給藥，達(dá)到燒傷創(chuàng)面愈合的效果。結(jié)果表明，KGF-2/NPaFGF@MN可成功穿過焦痂，并依次釋放KGF-2和aFGF。本研究通過減少壞死組織、加快再上皮化、增強(qiáng)膠原沉積和增加新生血管等多方面影響，加快了創(chuàng)面愈合速率。進(jìn)一步的證據(jù)表明，燒傷創(chuàng)面中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1ɑ)和熱休克蛋白90(Hsp90)的表達(dá)顯著升高，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。相關(guān)工作以題目為“Microneedle Patch for Transdermal Sequential Delivery of KGF-2 and aFGF to Enhance Burn Wound Therapy”于2024年4月16日發(fā)表在雜志《small》上。

1. 主要內(nèi)容

通常根據(jù)嚴(yán)重程度和穿透皮膚層的程度燒傷可以被分為第一、第二、第三和第四度。例如，二度燒傷同時造成皮膚的表皮和真皮層損傷，會影響血管，并部分破壞疼痛感受器。燒傷通常會導(dǎo)致慢性傷口。燒傷的嚴(yán)重性歸因于其會破壞角質(zhì)形成細(xì)胞，導(dǎo)致再上皮化延遲，此過程通常伴有焦痂形成，進(jìn)一步抑制表皮再生。其次，受損的血管無法為創(chuàng)面提供足夠的氧氣和營養(yǎng)，導(dǎo)致真皮創(chuàng)面愈合延遲。因此，迫切需要有效的策略來促進(jìn)早期上皮化、血管重建和無瘢痕的創(chuàng)面修復(fù)。

圖1 微針制造與表征

使用甲基丙烯酸化透明質(zhì)酸(HA-MA)在硅微針模具中經(jīng)過核黃素誘導(dǎo)的光聚合方法構(gòu)建了包載有KGF-2和NPaFGF的微針貼片。KGF-2/NPaFGF@MN由于存在核黃素而呈黃色，此微針貼片易彎曲，是具有排列良好的錐形針。對KGF-2和aFGF進(jìn)行熒光標(biāo)記，可以在共聚焦影像中直觀地觀察到微針對KGF-2和NPaFGF實現(xiàn)了完美的裝載。為進(jìn)一步證明微針的有效穿透作用，在壓縮情況下測試了微針的強(qiáng)度。隨后，作者對微針在皮膚表面的穿透能力進(jìn)行了探究，對燒傷創(chuàng)面小鼠給予KGF-2/NPaFGF@MN處理，取皮膚進(jìn)行H&E染色，觀察微針在皮膚中的穿透深度。結(jié)果表明，該微針可成功用針損傷皮膚，穿透皮膚真皮層，使生長因子進(jìn)入皮膚發(fā)揮促進(jìn)傷口愈合的作用成為可能。

圖2 傷口愈合實驗

本文利用小鼠二度燒傷模型評估KGF-2/NPaFGF@MN對燒傷創(chuàng)面的治療效果。創(chuàng)面成功創(chuàng)建后，將PBS(對照)、空白微針(MN，不加載生長因子)、游離KGF-2與游離aFGF的組合、游離KGF-2與NPaFGF的組合以及KGF-2/NPaFGF@MN處理創(chuàng)面。于第0、3、7、10、14天拍攝創(chuàng)面照片，直觀評價創(chuàng)面愈合效果，并根據(jù)照片測量相對創(chuàng)面大小，定量比較各組創(chuàng)面愈合情況。

圖3 不同處理后創(chuàng)面組織H&E染色的代表性圖像以及創(chuàng)面肉芽組織間隙統(tǒng)計曲線

在組織病理學(xué)水平進(jìn)一步評估KGF-2/NPaFGF@MN對燒傷創(chuàng)面的治療效果。分別于第3、7、14天對燒傷創(chuàng)面進(jìn)行H&E染色組織學(xué)評估。第3天，各組均出現(xiàn)表皮損傷，真皮水腫，治療后第7天，創(chuàng)面逐漸進(jìn)展至修復(fù)期。隨著時間的推移，各組創(chuàng)面愈合率的差異越來越明顯。第14天，與其他組相比，對照組整體上皮化程度最低，表皮再生最差，這可能是由于殘留的壞死表皮阻礙了創(chuàng)面愈合。KGF-2/NPaFGF@MN組瘢痕下有新生細(xì)胞，創(chuàng)面上皮層清晰，表皮大面積修復(fù)。真皮水腫消失，外觀接近正常皮膚。值得注意的是，由于壞死組織容易被蘇木精染色，對照組和微針組圖像均呈現(xiàn)出較強(qiáng)的顏色。根據(jù)H&E染色，進(jìn)一步對治療后創(chuàng)面的肉芽組織間隙進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)KGF-2/NPaFGF@MN組肉芽組織間隙最窄。所有數(shù)據(jù)表明KGF-2/NPaFGF@MN的創(chuàng)面愈合效果最好。

圖4 不同處理后的創(chuàng)面組織切片Masson三色(MT)染色的代表性圖像(藍(lán)色=膠原;紅色=細(xì)胞質(zhì)和肌纖維)。蘇木素(紫色)染色細(xì)胞核。黑色的圓圈表示焦痂。

Masson三色染色結(jié)果說明了組間膠原形成的差異。治療后第3天，各組真皮均可見少量膠原沉積。第7天時真皮膠原沉積增多，第14天時膠原沉積量更大。第14天，KGF-2/NPaFGF@MN組成熟膠原纖維明顯(亮藍(lán)色)且排列密集，其余各組仍有部分未發(fā)育的膠原纖維。這進(jìn)一步證明了KGF-2/NPaFGF@MN的愈合效果優(yōu)于其他各組。

圖5 不同處理后創(chuàng)面組織細(xì)胞角蛋白免疫組織化學(xué)染色代表性圖像以及創(chuàng)面表皮間隙的統(tǒng)計曲線

在創(chuàng)面修復(fù)過程中，角質(zhì)形成細(xì)胞從創(chuàng)面邊緣遷移至創(chuàng)面中心，并逐漸閉合創(chuàng)面，這一過程稱為再上皮化。實際上，再上皮化對燒傷創(chuàng)面愈合至關(guān)重要，燒傷創(chuàng)面表皮的嚴(yán)重受損會影響角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移。因此，在本研究中，我們對角蛋白進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色，以評估傷口愈合過程中的再上皮化。各組創(chuàng)面組織均出現(xiàn)不同程度的再上皮化。在整個愈合過程中，對照組再上皮化最慢，表皮遷移速度較慢，而KGF-2/NPaFGF@MN組表皮遷移速度最快，與H&E和MT染色結(jié)果一致。此外，圖6中黑色虛線所示的焦痂也表明，應(yīng)用KGF-2/NPaFGF@MN可以減少焦痂形成。由此可見，KGF-2/NPaFGF@MN組通過加速角質(zhì)形成細(xì)胞遷移、成纖維細(xì)胞增殖、肉芽組織形成和膠原沉積，促進(jìn)創(chuàng)面更快愈合。

圖6 微針貼片促進(jìn)血管生成

由于創(chuàng)面部位的血管嚴(yán)重受損，因此血管系統(tǒng)及時再生(血管生成)對于創(chuàng)面修復(fù)至關(guān)重要。有鑒于此，作者通過CD31與α-SMA兩個指標(biāo)對血管進(jìn)行雙重免疫熒光染色，來檢測微針在創(chuàng)面中誘導(dǎo)血管生成的能力。CD31和α-SMA是血管生長的兩個重要指標(biāo)，其表達(dá)變化提示血管生成的動態(tài)平衡。結(jié)果表明，KGF-2/NPaFGF@MN處理后的創(chuàng)面血管生長明顯加快，對創(chuàng)面的再生具有明顯的支持作用，是所有治療方法中創(chuàng)面愈合效果最好的。

血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)在協(xié)調(diào)血管穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，是血管發(fā)生和血管生成的主要調(diào)節(jié)因子之一。KGF-2/NPaFGF@MN中VEGF的高表達(dá)被認(rèn)為促進(jìn)了血管生成，最終促進(jìn)了傷口愈合。因此，KGF-2/NPaFGF@MN通過促進(jìn)新血管系統(tǒng)的快速再生促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合。

圖7 微針可上調(diào)HIF-1α和Hsp90的表達(dá)

HIF-1α和Hsp90都是通過調(diào)節(jié)血管生成和血管重塑協(xié)同加速創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵因子。燒傷后血管完整性受損，導(dǎo)致HIF-1α和Hsp90表達(dá)下調(diào)。本研究采用免疫組織化學(xué)染色和蛋白印跡法檢測HIF-1α和Hsp90在創(chuàng)面中的表達(dá)，以進(jìn)一步闡明創(chuàng)面愈合的機(jī)制。如圖8A所示，與Hsp90和HIF-1α表達(dá)最低的對照組相比，MN和含aFGF的游離KGF-2都調(diào)節(jié)了Hsp90和HIF-1α的水平，表明MN和生長因子可以正向啟動Hsp90和HIF-1α的表達(dá)。而KGF-2+NPaFGF組的Hsp90和HIF-1α染色陽性率高于KGF-2+aFGF組，表明納米粒的aFGF釋放模式可以提高aFGF在創(chuàng)面中的生物效應(yīng)。最重要的是，KGF-2/NPaFGF@MN處理組顯示出極高的Hsp90和HIF-1α水平，證實了MN作為藥物遞送系統(tǒng)以及KGF-2和NPaFGF雙重驅(qū)動因子在燒傷創(chuàng)面修復(fù)中的積極作用。綜上所述，這些結(jié)果證實了燒傷創(chuàng)面中Hsp90和HIF-α的上調(diào)可顯著提高創(chuàng)面修復(fù)率。它們可能成為未來促進(jìn)燒傷創(chuàng)面再生的靶調(diào)控因子。

2. 總結(jié)與展望

在本研究中，開發(fā)了一種新型的微針貼片，以實現(xiàn)燒傷創(chuàng)面治療中KGF-2和aFGF的不同釋放模式。首先將aFGF包裹在PLGA納米粒中，實現(xiàn)aFGF相對緩慢的釋放。然后將NPaFGF與KGF-2結(jié)合形成MN補(bǔ)片(KGF-2/NPaFGF@MN)。以核黃素作為光引發(fā)劑制備MN。本文是第一個報道基于生長因子釋放核黃素的微核貼片的文獻(xiàn)。KGF-2/NPaFGF@MN在體內(nèi)表現(xiàn)出較高的愈合效率，減少了焦痂形成，增加了肉芽形成、膠原沉積和新生血管形成。這是因為KGF-2/NPaFGF@MN通過釋放KGF-2促進(jìn)再上皮化和aFGF促進(jìn)真皮形成以閉合創(chuàng)面間隙，共同加速創(chuàng)面修復(fù)過程。此外，免疫染色和蛋白印跡法研究表明，這種新型補(bǔ)片可以顯著上調(diào)Hsp90和HIF-1α，進(jìn)而誘導(dǎo)血管生成和促進(jìn)傷口愈合。以上結(jié)果表明，聯(lián)合或序貫釋放不同的GFs是治療燒傷創(chuàng)面的一種有前景的策略。

文章來源：https://doi.org/10.1002/smll.202307485