據聯合國糧食及農業組織(FAO)統計，我國是馬鈴薯種植面積最大的國家，種植面積穩定在8000萬畝以上，全國馬鈴薯鮮薯產量達一億噸。在馬鈴薯貯藏過程中為防止其發芽、變綠，常在馬鈴薯收獲的前2~4周內，用 0.2% (質量分數 )馬來酰肼(MH)溶液進行葉面噴灑。MH又名抑芽丹，是一種植物生長抑制劑，能有效抑制植株頂端分生組織細胞分裂，破壞植株頂端優勢，強烈抑制芽的生長，常被用于抑制馬鈴薯、洋蔥、大蒜等蔬菜貯藏期的發芽。研究發現，MH是一種誘變致癌劑，一定劑量下會導致細胞染色體斷裂，從而產生細胞毒性，對人和高等動物有潛在風險。據中國馬鈴薯協會統計，中國人均食用馬鈴薯消費量為31.3kg·a-1，日均消費量為85.75g·d-1。因此，建立馬鈴薯中 MH殘留的簡便、快速的檢測方法已成為保障人民身體健康的迫切需求。
目前，MH殘留的檢測方法主要有蒸餾-分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)、氣相色譜法、毛細管電泳法、拉曼光譜法、化學發光法、差分脈沖伏安法等。較為常見的是前3種方法，其中蒸餾-分光光度法是美國分析化學家協會(AOAC)最初采用的方法，其依賴MH在濃堿及高溫條件下被鋅還原成肼，同時用氮氣保護，將生成的肼蒸餾出來，在酸性溶液中與對二甲基氨基苯甲醛反應生成黃色化合物，再用分光光度法進行檢測。該過程需要濃堿、高溫條件，以及蒸餾等步驟，前處理復雜，操作繁瑣，導致方法重復性不好。HPLC檢測靈敏度較差，若想達到較低的檢出限，則需要濃縮、復溶等一系列復雜的前處理手段。LC-MS/MS檢測MH雖有較高的靈敏度，但儀器成本高，難以作為常規檢測手段。根據MH的化學結構，它在弱酸性、堿性條件下呈陰離子狀態，并且具有紫外吸收，因此可采用帶有紫外檢測器的離子色譜法進行分析檢測。
鑒于此，研究人員提出了離子交換色譜-紫外檢測器法測定馬鈴薯中MH殘留量的方法。相較于蒸餾-分光光度法、HPLC等傳統檢測方法，該方法前處理簡單，更易于推廣為常規檢測方法；相較于離子排斥色譜法，該方法更加通用，同時流動相避免了有機溶劑的引入，符合綠色環保的理念，且流動相由KOH淋洗液發生器在線產生，不僅基線噪聲更低，還避免了手動配制流動相產生的誤差及二氧化碳的影響，有效提高了方法的精密度和穩定性。
1、試驗方法
本文分析的市售馬鈴薯均未檢出 MH，因此將馬鈴薯浸泡在MH標準溶液中可簡單模擬MH殘留的馬鈴薯樣品。將馬鈴薯洗凈，切成厚片，浸泡于500mg·L-1MH標準溶液中，再置于2~8℃冰箱中放置24h。24h后取出，洗凈、去皮、攪碎。稱取樣品處理后的樣品于離心管中，加入甲醇，超聲，每隔5min振搖1次，使樣品分散均勻，然后于60℃水浴加熱，室溫下離心，上清液過0.22μm聚醚砜針式濾器和IC-RP反相前處理柱，濾液按照儀器工作條件進行測定。
2、結果與討論
2.1 提取溶劑的選擇
試驗采用陰離子交換色譜柱，流動相為堿性溶液，若提取溶劑選擇不當，不僅會影響提取效率，還會影響待測物的保留時間和檢測結果。試驗考察了含20mmol·L-1氫氧化鈉的甲醇溶液、20mmol·L-1氫氧化鈉溶液、水以及甲醇分別作為提取溶劑時模擬馬鈴薯樣品中MH的測定值，結果如圖1所示。
由圖1可知，以甲醇和含20 mmol·L-1氫氧化鈉的甲醇 溶 液 為 提 取溶劑時，MH測定值分別為44.19μg·g-1和45.37μg·g-1，略高于以20mmol·L-1氫氧化鈉溶液和水為提取溶劑時的(MH測定值分別為36.23μg·g-1和34.90μg·g-1)。考慮到加入堿會影響溶液酸度，從而影響待測物的出峰時間，試驗選擇以甲醇為馬鈴薯中MH的提取溶劑。
2.2 儀器工作條件的選擇
2.2.1 淋洗液發生器的使用
陰離子交換色譜柱的流動相可通過 KOH淋洗液發生器在線產生，也可用手動配制的NaOH溶液。試驗考察了這兩種方式的流動相對MH檢測的影響，淋洗液發生器采用的流動相為3mmol·L-1KOH 溶液，手動配制的流動相為3mmol·L-1NaOH溶液，結果如圖2所示。
結果表明，采用KOH淋洗液發生器的基線噪聲比采用手動配制NaOH溶液的小。這是由于NaOH溶液在手動配制過程中會吸收空氣中二氧化碳，對基線造成一定的影響，而淋洗液發生器可實時制備出較為純凈的KOH溶液，避免了雜質干擾。因此，試驗采用KOH淋洗液發生器提供流動相。
2.2.2 色譜柱
試驗考察了Dionex IonPac AS11-HC和AG11-HC、Dionex IonPac AS15和AG15、Dionex IonPac AS16和AG16、Dionex IonPac AS18 和AG18以及 Dionex IonPac AS19和AG19等5種色譜柱(前者為分析柱，后者為保護柱)對模擬馬鈴薯樣品中MH色譜峰的影響，結果見圖3。
結果表明：采用Dionex IonPac AS11-HC和AG11-HC 色譜柱分離時(流動相為1mmol·L-1KOH溶液)，基線不穩定，且MH出峰前出現保留時間為12.75min的未知峰(由于含量太少，圖中未能顯示)，與MH的分離度為1.22，小于1.5，不適用于MH的分離檢測；采 用Dionex IonPac AS19和AG19色譜柱分離時(流動相為5mmol·L-1KOH溶液)，MH顯示為倒峰，可能是由于模擬樣品中有其他物質與MH在同一位置出峰，且在205nm 檢測波長下的吸光度比基線小，不宜用于MH的檢測；Dionex IonPac AS15 和AG15 (流動相為10mmol·L-1KOH 溶液)、Dionex IonPac AS16和AG16(流動相為3mmol·L-1KOH溶液)、Dionex IonPac AS18和 AG18(流動相為5mmol·L-1KOH溶液)色譜柱均可較好地分離MH，但Dionex IonPac AS16和AG16色譜柱得到的MH色譜峰峰高相對較高，半峰寬相對較小,對稱性較好。因此，試驗選用Dionex IonPac AS16和AG16 色譜柱進行檢測。
2.2.3 洗脫程序
試驗考察了KOH溶液濃度分別為3，4，5mmol·L-1時模擬馬鈴薯樣品中MH的分離情況，結果見圖4。
結果表明，當KOH溶液濃度由5mmol·L-1降低至3mmol·L-1時，MH 色譜峰與前面未知峰的分離度逐漸增加，其中3，4mmol·L-1KOH溶液得到的MH分離度(1.99，1.68)均滿足大于1.5的要求。鑒于3mmol·L-1KOH溶液得到的MH分離度更好，且保留時間也比較合理，試驗選擇以3mmol·L-1 KOH溶液分離MH。MH洗脫分離后，立即將KOH溶液濃度升至30 mmol·L-1來沖洗雜質，最后再將KOH溶液濃度降至3mmol·L-1平衡系統。
2.3 系統適用性
按照儀器工作條件分別對空白溶液、未浸泡MH的樣品溶液以及2.028mg·L-1MH 標準溶液進行測定，考察MH的干擾情況，結果見圖5。
由圖5可知，空白溶液和未浸泡MH 的樣品溶液中均未出現干擾MH的物質，說明該方法對馬鈴薯中MH的檢測不存在干擾。
2.4 方法學驗證
2.4.1 標準曲線、檢出限和測定下限
取10，20，50，80，100μL1014mg·L-1MH標準儲備溶液，用水定容至10mL，搖勻，即得質量濃度分別為1.014，2.028，5.070，8.112，10.14mg·L-1的MH標準溶液系列；分取360μL5.070mg·L-1MH標準溶液，用水定容至10mL，搖勻，即得質量濃度為0.1825mg·L-1的 MH標準溶液。按照儀器工作條件對上述6個濃度水平的MH標準溶液進行測定，以MH質量濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標進行線性回歸。結果表明：MH標準曲線的線性回歸方程為y=2.194x-0.06424，相關系數為0.9999，線性范圍為0.1825~10.14mg·L-1。
分別以3，10倍信噪比(S/N)確定檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N)，結果分別為0.06mg·L-1和0.18mg·L-1。
2.4.2 儀器精密度和重復性試驗
將2.028mg·L-1MH標準溶液按照儀器工作條件測定6次，結果顯示，MH的保留時間和峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.073%，3.7%，表明儀器穩定，精密度較好。
取同一模擬馬鈴薯樣品，按照試驗方法平行處理6份并測定，結果顯示，MH的保留時間、測定值和峰面積的 RSD分別為0.15%，3.8%，3.4%，表明本方法重復性較好。
2.4.3 穩定性試驗
將2.082mg·L-1MH標準溶液及模擬馬鈴薯樣品溶液在室溫下放置，于 0，6，12，18，24h分別進行測定。結果顯示：標準溶液中MH的保留時間和峰面積的RSD分別為1.6%，2.2%，模擬馬鈴薯樣品溶液中MH的保留時間和峰面積的RSD分別為1.3%，1.8%，說明24h內MH的穩定性良好。
2.4.4 耐用性試驗
試驗考察了柱溫、流量和檢測波長這3個參數的耐用性。
改變柱溫為28℃和32℃，其他條件不變，對2.082mg·L-1MH標準溶液測定6次，對模擬馬鈴薯樣品溶液測定1次。結果表明：當柱溫為28，32℃時，MH色譜峰與未知峰的分離度分別為1.91和2.10，均滿足分離度大于1.5的要求；6次測定的MH峰面積的RSD 分別為4.0%和4.4%，精密度較好，說明柱溫為(30±2)℃時對MH的檢測沒有影響。
改變流量為0.9 mL·min-1和1.1mL·min-1，其他條件不變，對2.082mg·L-1MH標準溶液測定6次，對模擬馬鈴薯樣品溶液測定1次。結果表明：當流量為0.9，1.1mL·min-1時，MH色譜峰與未知峰的分離度分別為1.95和2.03，均滿足分離度大于1.5的要求；6次測定的MH峰面積的RSD分別為3.1%和4.1%，精密度較好，說明流量為(1.0±0.1)mL·min-1時對MH 的檢測沒有影響。
改變檢測波長為203nm和207nm，其他條件不變，對2.082mg·L-1MH標準溶液測定6次，對模擬馬鈴薯樣品溶液測定1次。結果表明：當檢測波長為203，207nm 時，MH色譜峰與未知峰的分離度分別為1.97和2.00，均滿足分離度大于1.5的要求；6次測定的MH峰面積的RSD分別為4.1%和2.3%，精密度較好，說明檢測波長為(205±2)nm時對MH的檢測沒有影響。
2.4.5 回收試驗
在模擬馬鈴薯樣品中加入MH本底值80%，100%，120% 的 MH 標 準 品,即 分 別 加 入 22，28，33μL1014mg·L-1MH標準儲備溶液，每個濃度水平平行加標3次，按照試驗方法進行處理和測定，計算回收率，結果如表1所示。
表1 回收試驗結果
由表1可知：MH回收率為97.9%~108%，表明本方法的準確度較高。
2.5 樣品分析
隨機從4個商家購買4 份馬鈴薯樣品，按照試驗方法分析其中MH的殘留情況。結果顯示，馬鈴薯樣品中均未檢出MH(殘留量均低于檢出限)，遠低于GB 2763-2019《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》規定的馬鈴薯中 MH 的最大殘留量(50μg·g-1)。
3、試驗總結
本文提出了離子交換色譜-紫外檢測器法測定馬鈴薯中MH殘留量的方法，該方法分析快速，準確度高，重復性和穩定性均較好，可作為馬鈴薯中MH殘留檢測的通用方法，并可推廣到其他農產品如大蒜、洋蔥中MH的檢測和質量控制。
作者：王曉威，孟玲玲，蔡丹旎，于世強，劉鵬宇，欒紹嶸
單位：華東理工大學 化學與分子工程學院
來源：《理化檢驗-化學分冊》2024年第1期
