介紹
膿毒癥（sepsis）是一種由感染引起的宿主反應失調導致的危及生命的器官功能障礙，常常會導致多器官功能障礙，危及生命，是重癥監護病房（ICU）死亡的罪魁禍首1。新興的可穿戴技術為持續和同時監測人體表皮上的各種生物標志物提供變革性技術。近日，復旦大學孔繼烈，方雪恩在“Nature Communications”發文：Long-term monitoring of ultratrace nucleic acids using tetrahedral nanostructure-based NgAgo on wearable microneedles2。作者報告了一種基于四面體納米結構的格氏嗜鹽堿桿菌Argonaute（NgAgo），用于在可穿戴設備上長期穩定監測體內敗血癥的超痕量未擴增核酸（無細胞DNA和RNA）。這款集成的無線可穿戴設備由柔性電路板、微針生物傳感器和具有富集能力的可拉伸表皮貼片組成。體內實驗表明，它適合于細胞游離DNA和RNA的實時監測，靈敏度為0.3 fM，最長可達14天。這些結果為體內高靈敏度的分子識別和體內核酸檢測提供了一種策略。
圖1詳細介紹了可穿戴電子系統，該系統可在一段時間內（兩周以上）內以高靈敏度連續記錄未擴增的目標核酸的變化。如圖1a所示，該集成的可穿戴系統由一次性微針貼片和可重復使用的電子器件（無線柔性電路板、功能性熱塑性聚氨酯薄膜）組成。在本研究中，一次性微針（MN）貼片是由三電極陣列以一種緊湊的方式制成的，即三合一貼片。然后，通過噴霧印刷和鑄造技術制備了由第一層銀和第二層碳納米管組成的功能性熱塑性聚氨酯（TPU）。帶有陽極和陰極的功能化TPU薄膜分別與無線柔性電路板（FCB）連接，它能夠通過反向離子電泳富集核酸。集成的可穿戴系統的第三部分是自行設計和定制的FCB，用于電源和信號管理。
圖1b顯示了MN界面結構的示意圖。TDN-17被用作固定在石墨烯表面上的最佳納米支架。在本研究中，系統靈敏度的提高可能來自TDN的空間取向，如圖1c所示。TDN的剛性和分子水平的介導使ISF中的超痕量生物傳感成為可能，這在很大程度上涉及雙電層高度的增加。在TDN-17上，作為原核Argonautes之一的NgAgo蛋白被固定以形成NgAgo/引導DNA復合物，表示為NgAgo-gDNA。在gDNA（24-bp 5′-磷酸化單鏈DNA）的引導下，通過Watson-Crick堿基配對搜索整個靶序列。一旦匹配，固定的NgAgo-gDNA可以與靶核酸結合，由于候選gDNA的存在，靶核酸是明確確定的穩定的。
本研究從三個方面對MN進行了改進：
（I）利用SU-8光刻膠作為疏水、剛性、非膨脹性的材料，通過光刻法制備MN，這對于構建高性能的生物傳感界面具有重要意義；
（II）作為納米支架，TDN參與生物傳感界面以產生增強的信號輸出;
（III）NgAgo-gDNA錨定在TDN的頂部，形成TDN-NgAgo-gDNA（表示為TDN-Ng），由于使用gDNA，這提高了測定的長期穩定性。
圖1d概述了佩戴者表皮上的可穿戴電子設備，顯示了其完全集成、皮膚構象和緊湊性的特性。為了獲取記錄的電化學數據并傳輸到移動終端，可穿戴電子設備使用了三種電路，包括模擬前端（AFE）、反向離子電泳和藍牙低能（BLE），如圖1e所示。AFE為MN貼片的生物傳感提供了一個電路。反向離子導入模塊由電池獨立供電，以避免信號串擾。BLE作為一個數據采集模塊，與AFE進行交互。所有這些子組件都是由一個可充電的鋰離子電池供電的。
圖1：| 基于TDN-Ng的核酸實時監測的集成可穿戴系統綜述。a患者表皮可穿戴設備的工作流程和視圖。所有數據分別傳輸到電子設備RE、WE和CE，分別參考參考電極、工作電極和對電極。b插圖顯示了微針上的工程生物傳感界面，其中TDN作為錨點與石墨烯和NgAgo-gDNA結合，P指磷酸化。c生物傳感機制示意圖。增強的TDN-Ng界面選擇性地識別目標核酸，產生不同的電勢，產生電化學信號輸出。d佩戴在患者手臂上的整個集成可穿戴系統的照片。比例尺，1厘米。e柔性電路板電子器件的方框圖。電化學模擬前端（AFE）進行電化學傳感以獲取信號，藍牙低能（BLE）模塊處理信號，并通過藍牙天線將數據傳輸到外部電子設備。反向離子導入模塊與電池單獨連接。電池被連接到電路板和USB充電端口。比例尺，1厘米。
TDN-Ng MNs的體外評價
完成可穿戴系統開發后，作者對可穿戴系統進行了體外評價。作為一種集成的可穿戴電子系統，最終需要在真實場景中實現對目標核酸的實時監測。為了便于該系統的實際應用，作者進一步研究了其靈敏度、定量檢測、長期穩定性、特異性和抗干擾性能。結果顯示，所制備的TDN-Ng MNs貼片在體外表現出16天的長期穩定性，可實時定量、靈敏地監測不同濃度的靶cfDNA和RNA。文章也指出，TDN-Ng MN貼片可耐受0.3 nM的非特異性核酸和80%的胎牛血清（FBS）干擾，也可在特異性識別目標EBV cfDNA。
圖2：| TDN-Ng MNs對cfDNA和RNA的體外檢測性能。a. TDN Ng-MN貼片在受激ISF、37°C、pH 7.4和0.01M PBS中不同濃度cfDNA的實時電流反應b.電流相應與目標濃度的校準曲線。c. 從圖4b中收集的曲線斜率值d. TDN-Ng MN貼片在體外培養20天的長期穩定性 e. TDN-Ng特異性 f. TDN-Ng MN貼片在不同濃度胎牛血清下對3×10−12 M靶cfDNA的抗干擾性能。g. 研究NgAgo-gDNA復合物與3 nM RNA-168和RNA-351的結合能力。h.通過TDN-Ng MN記錄的RNA-168和RNA-351的動態變化。
使用集成MNs的體內監測的性能和評價
完成體外評價后，作者進行了體內評價。在這項工作中，作者進一步驗證了TDN-Ng MNs在體內用于實時監測核酸。結果顯示，該TDN-Ng MN系統不僅能有效區分陽性組和NTC組，而且還能可靠地監測體內靶標cfDNA和RNA的動態變化。此外，該TDN-MN裝置也可在體內表現出14天的可靠穩定性。
圖3：| TDN-Ng MNs體內驗證。a. 在小鼠模型實驗中，實時監測的示意圖和時間線，在整個實驗過程中，對一只小鼠使用一個TDN-Ng MN貼片。每只小鼠均進行(I)化學發光生物成像，（II）TDN-Ng MNs，（III）PCR檢測。TDN-Ng MN貼片首先在PBS（37°C，0.01M，pH 7.4）中校準100秒，以消除使用前的傳感器背景變化。藍線表示工作模式。小鼠皮膚處理步驟如下：角質層磨砂膏，75%乙醇消毒，TE緩沖液（pH 8.0）涂抹，棉花干燥。在整個過程中，小鼠被固定在一個熱板上。b. 小鼠在不同時間點的2h、24 h、48 h、168 h的平行演示。c.在2h、24 h、48 h、168 h時，實時動態曲線的斜率值。d. 通過TDN-Ng MNs和金標準PCR記錄的體內靶cfDNA的動態變化。 e用TDN-Ng MNs和金標準PCR和RT-PCR檢測靶標cfDNA和RNA的相應圖譜。f. TDN-Ng MNs在體內的長期穩定性。g. 用TDN-Ng MN貼片在36 h內連續實時監測SA膿毒癥小鼠。h.用TDN-Ng MN貼片在36 h內連續實時監測PA膿毒癥小鼠。
總結
綜上所述，本研究提出了無線集成可穿戴電子設備，通過工程生物傳感接口實時監測膿毒癥相關動物模型的縱向核酸。
基于TDN和Ng系統的協同作用，可穿戴系統能夠連續跟蹤體內無細胞DNA和RNA靶點的動態變化，靈敏度為0.3 fM，在體內17天內具有可靠的穩定性。
作者還討論了TDN-17隨空間高度增加對TDN-Ng系統的靈敏度增強和實時監測動態平衡的機理。
目前這項工作的無擴增策略代表了基于核酸的可穿戴設備的飛躍，并加速了用于ICU醫療保健管理的下一代生物傳感器的出現。
參考文獻：
[1]Ma Z, Jiang Z, Li H, et al. Prevalence, early predictors, and outcomes of sepsis in neurocritical illnesses: A prospective cohort study[J]. American Journal of Infection Control, 2024.
[2]Yang B, Wang H, Kong J, et al. Long-term monitoring of ultratrace nucleic acids using tetrahedral nanostructure-based NgAgo on wearable microneedles[J]. Nature Communications,
