近年來寡核苷酸藥物成為新藥研發中備受關注的分子類型，被認為是繼小分子化藥、抗體藥物之后的第三代治療藥物。寡核苷酸是指含有約20個堿基的短鏈核苷酸，通過以Watson-Crick堿基互補配對的原理與mRNA互補鏈結合，作用于轉錄和翻譯。根據結構和作用機理不同，分為反義寡核苷酸（ASO）、小干擾RNA（siRNA）、小激活RNA（saRNA）、微小RNA (miRNA)、適配體(Aptamer)等。
由于siRNA藥物療效較好且技術取得突破，這使得它成為目前最受關注的核酸藥物之一。siRNA是一類雙鏈RNA分子（反義鏈、正義鏈），通過與體內相關酶形成RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex, RISC）來降解目標mRNA，以此來下調或抑制目標基因的表達。2024年伊始，siRNA藥物領域的合作捷報頻傳：1月3日，勃林格殷格翰宣布與蘇州瑞博及其瑞典子公司Ribocure達成合作協議，共同開發治療非酒精性或代謝功能障礙相關脂肪性肝炎的小核酸創新療法。1月7日，舶望制藥宣布與諾華就RNAi療法達成兩項獨家許可合作協議。
截至目前，FDA共批準6款siRNA上市藥物。值得一提的是，其中有4款來自Alnylam，1款來自Alnylam與諾華共同開發，1款來自諾和諾德，治療領域主要為內分泌與代謝、神經、泌尿、心血管系統。6款藥物均靶向肝臟，并進行了化學修飾。除了Onpattro遞送方式為LNP（脂質納米粒），并且給藥方式為靜脈輸注外，其它藥物的遞送系統均為GalNAc，給藥方式均為皮下注射，詳見表1。
表1六款siRNA上市藥物（截止2024.1）
由于siRNA自身的物理化學特性，未經修飾的siRNA給藥后不僅會很快被機體清除，同時還有脫靶毒性的風險。因此，需要同時借助化學修飾和合適的遞送系統來達到治療目的。已上市的6款siRNA藥物均使用了化學修飾和遞送系統。第一代化學修飾是對磷酸骨架的修飾，如硫代磷酸酯（PS）。第二代化學修飾是核糖修飾，其中2-O-甲基（2-OMe）、2-O-甲氧基-乙基（2-MOE）和2-氟（2-F）修飾是最常用的類型。第三代化學修飾為核糖五元環改造。經過化學修飾后，共同的特點是增加了siRNA的穩定性，但同時也存在一些缺點，如經PS修飾后降低與靶基因結合的親和力，與某些蛋白的非特異性相互作用可能引起細胞毒性。
單純通過化學修飾還是很難使siRNA到達靶部位。因此，遞送系統是寡核苷酸藥物研發中成功的關鍵因素，也是藥物研發公司的技術護城河。目前已上市的6款siRNA藥物，只有Patisiran遞送系統是LNP（圖1左），其余的遞送系統均為GalNAc（圖1右）。LNP主要由4部分組成：可電離脂質、膽固醇、輔助磷脂、PEG-脂質。其中，可電離脂質是最關鍵的輔料，它在不同的pH條件下表現出不同的帶電特征，酸性pH值條件下帶正電荷，而在生理pH條件下基本呈中性，可離子化特性為siRNA跨越生物屏障提供了智能化的保護。5款GalNAc-siRNA偶聯物均使用L96作為載體，該結構由三部分組成，包括三觸GalNAc靶頭、連接臂以及siRNA分子。GalNAc以三價態的方式共價偶聯至核酸3’末端，形成GalNAc-siRNA偶聯物。GalNAc是去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的配體，ASGPR在肝細胞的膜表面高度特異性表達。GalNAc-siRNA偶聯物通過特異性結合ASGPR，在內吞作用下將siRNA從細胞表面轉運至細胞中。隨后GalNAc-siRNA偶聯物與ASPGR分離，ASPRGR回到細胞表面，而GalNAc-siRNA偶聯物進一步解離，釋放出的游離siRNA在細胞質中沉默基因以發揮藥效。
圖1 遞送系統LNP, GalNAc及作用機制
siRNA藥物化學合成藥物，雖具備生物制品屬性，但按新化學實體監管。所以不僅在科學認知上存在一些缺口，也存在一些監管指南空缺。目前中國尚無相關指導原則。除了ICH系列指導原則外（ICH S6/M3/S7/S2/S8）,日本PMDA 2020年發布了《寡核苷酸治療產品非臨床安全性評價指導原則》可供參考；FDA也發布了用于工業界的相關指導原則，如《寡核苷酸治療藥物開發的臨床藥理學考慮》等。根據日本PMDA發布的《寡核苷酸治療產品非臨床安全性評價》指導原則，siRNA藥物需要2個種屬進行臨床前安全性評價，嚙齒類為大鼠或者小鼠，非嚙齒類一般為食蟹猴。目前已上市的6款siRNA，非嚙齒類均是食蟹猴，嚙齒類分別為大鼠（5款）、小鼠（Nedosiran）。非嚙齒動物選擇猴的主要原因如下：猴和人的目標mRNA具有高度或完全同源性，而且猴種屬可以更好地評估siRNA放大的藥理學效應，比如Inclisiran核苷酸序列與人和猴PCSK9中的類似序列完全同源，且用猴開展藥效。siRNA藥物臨床前評價動物種屬選擇見圖2。
圖2 siRNA藥物臨床前評價動物種屬選擇
根據已上市的6款siRNA藥物申報資料，臨床前開展的安全性評價試驗總結如表2。
表2六款siRNA藥物臨床前安評試驗總結
考慮到已上市的6款siRNA藥物臨床前毒理數據較多，僅以遞送系統為LNP的藥物Patisiran，遞送系統為GalNAc的藥物Inclisiran為代表，分析臨床前安評結果。Patisiran是Alnylam研發，于2018.8 FDA批準上市的首款siRNA藥物。適應癥為遺傳性轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（hATTR）引起的周圍神經病變疾病，靶點TTR（轉甲狀腺素蛋白）基因。臨床給藥為靜脈滴注，3周一次, 0.3 mg/kg。遞送載體為LNP。作用機制是通過RNA干擾引起突變型和野生型TTR mRNA的降解，從而導致血清TTR蛋白和組織中TTR蛋白沉積的減少，達到治療疾病的目的。Patisiran臨床前安評結果如表3。
表3 Patisiran臨床前安評總結（備注：如26W+12W表示26周給藥，伴隨12周恢復期）
表3 Patisiran臨床前安評總結（續）
Inclisiran研發公司Novartis/Alnylam，于2020.12歐盟首次獲批，全球首個siRNA降膽固醇療法藥物，適應癥原發性高膽固醇血癥或混合性血脂異常，靶點PCSK9。臨床給藥途徑為皮下注射，第0、3個月各給藥一次后，維持期6個月一次，一年只需2次。遞送系統為GaINAc，作用機制是與編碼PCSK9蛋白的mRNA結合，通過RNA的干擾作用來防止肝臟生成PCSK9蛋白，從而達到降低血脂的目的。Inclisiran臨床前安評結果總結如表4。
表4 Inclisiran臨床前安評總結
表4 Inclisiran臨床前安評總結（續）
為了探究已上市的6款siRNA非臨床毒性和臨床主要不良反應是否有關聯性，通過整理支持NDA的NHP長毒試驗毒性結果，以及臨床警告和注意事項，得出非臨床和臨床關聯性較強的是肝臟毒性，需要關注血生化一些指標變化，如ALT, AST，可在臨床階段進行密切監控。具體情況見表5。
表5 六款siRNA藥物非臨床和臨床毒性關聯性分析（*：數據來源于支持NDA的NHP長毒試驗）
因為siRNA藥物具備大分子藥物屬性，所以也需要進行免疫毒性考察。對已上市的6款siRNA藥物免疫毒性進行總結，如抗藥抗體（ADA）、細胞因子(CKs)、補體、免疫表型(IPT)。具體結果見表6。
表6六款上市siRNA藥物免疫毒性總結(“-”表示未披露)
理論上講，若siRNA和靶mRNA準確地結合在一起，則可成功的沉默靶基因。然而，許多siRNA都存在脫靶，并且大多數siRNA分子可能并不具有靶向性。siRNA的引入可導致脫靶效應，即抑制目標基因以外的其他基因，導致非靶基因表達突變的意外后果。根據日本藥品醫療器械管理局（PMDA）發布的《寡核苷酸治療產品非臨床安全性評價指導原則》，寡核苷酸的毒性分析分為靶向毒性、脫靶毒性，詳細見圖3。
圖3 siRNA藥物毒性分類
肝臟是siRNA藥物最關注的器官。關于肝臟毒性，通過總結已上市的6款siRNA藥物，將從藥物特點、藥代、病理進行綜合性分析。藥物特點方面，6款siRNA藥物靶點均與肝臟相關，在肝臟中合成或表達；均進行了化學修飾，如經硫代磷酸脂修飾后可能導致高蛋白結合的肝毒性；遞送系統無論是LNP或GalNAc均有肝靶向性。目前LNP-siRNA藥物Patisiran靜脈給藥后80%~90%的LNP會進入肝臟，最終被肝細胞吸收；GalNAc-siRNA經ASGPR介導發生細胞內吞而進入靶組織，ASGPR在肝細胞上大量表達。藥代方面，組織分布結果均顯示肝臟濃度最高，如Lumasiran猴10mg/kg時，AUC高達76700h*μg/mL,且消除半衰期長，高達409h。用于支持NDA的猴長毒試驗中，組織病理均發現肝臟變化，從輕到重依次是：（1）肝細胞/枯否細胞嗜堿性顆粒：可能為供試品或其代謝產物，也可能是細胞攝取寡核苷酸的適應性改變；（2）肝細胞空泡化：可能為繼發于胞漿內嗜堿性顆粒蓄積的改變；（3）炎癥浸潤：高濃度藥物分布時，會激活促炎性通路（4）肝細胞單細胞壞死：高劑量下嗜堿性顆粒大量蓄積時可觀察到病理損傷。此外，大部分藥物還伴隨血生化臨檢指標變化，如ALT, AST升高。組織的病變是否為有害變化，要根據組織本身的損傷，相關指標的變化，可恢復情況，以及其它的siRNA藥物是否有類似改變等綜合判斷。
除了肝毒性，序列相關引起的脫靶毒性還有免疫刺激反應，其毒性在很大程度上取決于核苷酸序列設計和化學修飾。siRNA藥物通過激活先天免疫系統，導致注射部位反應(如Patisiran，Inclisiran)、血小板（PLT）減少(如Patisiran, Givosiran)。免疫刺激評估，除了體內試驗相關指標的檢測，也可在體外用分離的外周血單核細胞或全血測定預測細胞因子釋放來評估。
非雜交相關的脫靶毒性，如凝血功能改變，siRNA藥物通過抑制凝血級聯反應中的因子IXa和輔助因子VIIIa，進而選擇性的抑制了部分凝血酶的作用時間，從而以一種與雜交和序列無關的方式抑制凝血（如Patisiran，Lumasiran APTT輕微升高）。此外，siRNA藥物還可以結合抑制性因子H激活補體旁路，補體過度激活可使補體功能改變，引發繼發性炎癥和血管炎等（如Patisiran C3a升高，發現肝臟炎癥浸潤、輸注部位血管周圍炎癥）。
除了關注siRNA藥物本身外，還要關注遞送系統毒性，如LNP。LNP含有新的輔料，或成分比例發生了改變，需要對LNP進行考察。雖然沒有專門針對LNP的指導原則，但可以參考相關指導原則，如《新藥用輔料非臨床安全性評價指導原則》、《納米藥物非臨床安全性研究技術指導原則》、《Guidance for Industry : Liposome Drug Products Chemistry, Manufacturing, and Controls; Human Pharmacokinetics and Bioavailability; and Labeling Documentation》等。此外，還可以參考Patisiran關于LNP的考察。若LNP是按非單獨輔料注冊標準申報，且考慮到siRNA需要兩種動物種屬，可按與非臨床安全性評價中相同的動物種屬伴隨或單獨考察LNP。IND申報LNP需要開展的毒理試驗推薦見表7。
表7 LNP毒理IND評價(非單獨輔料注冊標準)
據報道，siRNA藥物發展方向依然主要集中在遞送系統、修飾、脫靶效應、適應癥拓展方向，且相輔相成。比如在遞送系統方面，Alnylam開發了一種連接到siRNA的短脂質鏈——C16偶聯物，使其能被多種類型細胞吸收(CNS,肺，眼等)，從而拓展了siRNA類藥物適應癥；新的遞送平臺GalAhead™和PDoV-GalNAc提供了更高的遞送效率。在修飾方面，例如增強穩定性化學(ESC)，很多在研項目已經開始使用了。關于脫靶應在藥物設計時就考慮，而不是通過毒理評估。如Alnylam公司對siRNA脫靶預測，淘汰不符合要求的siRNA序列。
2018年，第一款siRNA藥物Onpattro的批準上市對siRNA藥物領域產生了重大影響，標志著諾貝爾獎成果已從理論概念轉變為實際治療用途，這是一個引人注目的里程碑。截至2024年1月，已有6款siRNA藥物上市。通過對這6款已上市siRNA藥物臨床前安評總結分析，可以為此類藥物臨床前毒理設計提供參考。相信將來會有更多的siRNA藥物上市，而相關的臨床前指導原則也將隨之逐漸完善和發布。
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