超聲檢測原理是基于聲波傳播和反向散射行為，探查不同深度的非透明組織，并且無需調(diào)節(jié)樣本，是一種可以克服光衍射限制的非破壞性技術(shù)。該技術(shù)通過定量成像方法、補償聲學效應(yīng)以及利用體積成像進行生物支架的可視化分析，從而提供客觀、準確且實時的生物支架開發(fā)表征數(shù)據(jù)，在研究軟骨修復策略領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。
本期，EFL 以發(fā)表在雜志《Acta Biomaterialia》上的“Standardised quantitative ultrasound imaging approach for the contact-less three-dimensional analysis of neocartilage formation in hydrogel-based bioscaffolds”研究為例，介紹一種通過對從組織中返回的射頻信號進行頻譜分析來實現(xiàn)標準化的定量超聲成像（SQUI）方法。作者以基于GelMA水凝膠構(gòu)建不同軟骨成熟水平的體外組織為例，來驗證SQUI方法的應(yīng)用潛力。
1. 為什么選擇GelMA水凝膠構(gòu)建不同軟骨成熟水平的體外組織？
GelMA水凝膠具有成分清晰，透光性好的優(yōu)點，常見應(yīng)用于各種水凝膠成像和分析技術(shù)。同時，GelMA水凝膠具有生物相容性優(yōu)，光照機械性能可調(diào)的特點，滿足該研究通過改變GelMA濃度（6%，8%，10% w/v）和培養(yǎng)時間（0，14，28天）來構(gòu)建具有不同軟骨成熟水平的體外組織模型的需求，這種可控的變化對于研究軟骨組織工程的動態(tài)至關(guān)重要。（EFL可提供系列GelMA產(chǎn)品，點擊文字查看詳細介紹 ）
2. 如何利用SQUI方法？
1）本文所研究的生物支架和所用超聲設(shè)備的概述
圖1 本研究所檢測的樣品及實驗裝置。
2）生物學表征
在進行SQUI方法評估前，作者先評估人脂肪源性間充質(zhì)干細胞（hADSCs）在光交聯(lián)GelMA水凝膠生物支架中經(jīng)軟骨分化后的透明軟骨細胞外基質(zhì)的表達差異化情況。評估包括對透明軟骨標志物（II型膠原蛋白和膠原纖維）的定量、II型膠原基因表達和提取的糖胺聚糖（GAG）。結(jié)果表明，GelMA濃度對II型膠原蛋白生物標志物COL2A1的含量有顯著影響，并與GelMA濃度成反比。
圖2 調(diào)控負載脂肪間充質(zhì)干細胞GelMA支架構(gòu)建不同的體外新生軟骨組織。
3）聲速、衰減和厚度的輪廓掃描
實驗結(jié)果顯示，聲速和衰減的輪廓，生物支架輪廓周圍的聲速值被低估，衰減圖像中出現(xiàn)雙環(huán)異常高衰減的偽影。這種偽影被歸因于換能器近場焦點與生物支架表面的相互作用，引起聲波束的折射。為了排除這些輪廓偽影，并評估支架整體的聲學屬性，選擇了支架內(nèi)部直徑約2mm的感興趣區(qū)域（ROI）。
圖3 無細胞和載細胞GelMA生物支架的輪廓掃描數(shù)據(jù)分析結(jié)果。
4）生物支架的2D/3D超聲成像
標準化定量超聲成像（SQUI）方法可視化分析了生物支架的微觀結(jié)構(gòu)和總體形態(tài)，并對2D原始灰度圖像與其對應(yīng)的局部衰減和IBC圖像進行了比較。2D-IBC圖像顯示了GelMA濃度的顯著差異。基于IBC圖像與顯微鏡圖像的相似性，假設(shè)高強度IBC特征歸因于ECM（細胞外基質(zhì)）的區(qū)域。3D圖像顯示了全局和閾值化IBC值。然后處理了生物支架足跡上每個柵格掃描平面的標準化2D-IBC圖像，并結(jié)合處理后的2D-IBC圖像形成了3D-IBC圖像。
圖4 第28天GelMA載細胞生物支架的代表性2D-IBC圖像。
圖5 不同時間點的GelMA載細胞支架的側(cè)視3D-IBC圖像。
5）3D-IBC圖像的體積量化
對渲染的3D圖像進行了總結(jié)，使其能夠進行定量評估。這些圖像通過其IBC分布的體積直方圖進行了分析。對于不同GelMA濃度（6%、8%、10%）的細胞生物支架，結(jié)果表明軟骨生成過程中的單調(diào)增加，特別是在log IBC區(qū)間-2.8至-1.4。對于10%的生物支架，與其他生物支架相比，28天時直方圖值出現(xiàn)衰減。
圖6 基于3D-IBC圖像計算獲得的體積直方圖。
6）Sonomarker強度作為軟骨形成描述符的鑒定&基于Sonomarker強度分析細胞生物支架
評估了體積直方圖以探究在軟骨形成過程中是否有特定的IBC強度經(jīng)歷了較大的變化，確定了聲學標記（sonomarker）的強度，作為軟骨形成的描述標志，對描述生物支架體積屬性及其在軟骨形成不同時間點的變化具有重要作用。
圖7 將3D-IBC圖像定量為體積直方圖，并識別新軟骨sonomarker強度。
7）基于Sonomarker下的生物支架選擇性成像
通過在特定的聲學標記Sonomarker呈現(xiàn)的3D圖像，有助于可視化生物支架的微觀結(jié)構(gòu)和ECM（細胞外基質(zhì)）的發(fā)展。
圖8 基于新生軟骨sonomarker強度，可視化GelMA生物支架的微觀結(jié)構(gòu)。
8）Sonomarker強度與生物標志物的相關(guān)性
探討了Sonomarker強度與生物標記之間的相關(guān)性。使用線性回歸分析比較了聲學標記直方圖與軟骨形成第28天時的主要生物標記（GAG、COL2A1和膠原纖維）之間的關(guān)系。聲學標記的強度與這些生物標記顯示出良好的相關(guān)性。
圖9 Sonomarker強度與標準新軟骨生物標志物的相關(guān)性。
9）SQUI方法在人類關(guān)節(jié)軟骨樣本上的應(yīng)用
研究了SQUI方法在人類關(guān)節(jié)軟骨樣本上的應(yīng)用，以驗證新軟骨聲學標記在天然組織中的相關(guān)性。這表明了SQUI方法在非破壞性分析軟骨再生方面的潛力。
圖10 基于SQUI方法對人關(guān)節(jié)軟骨標本的聲學評價。
3. 本文的創(chuàng)新點
本文的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在以下幾個方面：
（1）標準化定量超聲成像（SQUI）技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用：本研究開發(fā)了一種新的超聲成像方法，即SQUI，用于非破壞性三維成像和定量分析水凝膠基生物支架中的軟骨形成。這種方法克服了傳統(tǒng)成像技術(shù)的限制，如需破壞樣品或無法提供三維數(shù)據(jù)。
（2）生物支架的詳細聲學特性分析：該研究不僅評估了生物支架的形態(tài)變化，還通過測量聲速、衰減和厚度等聲學參數(shù)，對其物理和生物特性進行了全面分析。這為理解生物支架在軟骨工程中的行為提供了新的視角。
（3）定量分析與生物標志物的關(guān)聯(lián)：研究通過定量超聲成像技術(shù)分析了生物支架中新生軟骨形成的過程，并將其與傳統(tǒng)的生物標志物（如II型膠原、GAG）相關(guān)聯(lián)。這種方法的開發(fā)為評估和監(jiān)測生物支架中細胞活動和組織再生提供了新的工具。
（4）3D圖像的渲染與分析：通過渲染和分析3D-IBC圖像，本文展示了生物支架在軟骨生成過程中的形態(tài)變化。這種三維視角對于理解和優(yōu)化生物支架的設(shè)計至關(guān)重要。
（5）聲學標記的識別和應(yīng)用：研究中識別了特定的聲學標記強度，并將其用于分析生物支架的特性。這種方法的創(chuàng)新在于使用聲學參數(shù)作為評估和描述生物支架中軟骨形成的新指標。
4. 總結(jié)
該研究展示了超聲波的非破壞性體積和定量成像技術(shù)，在檢測以GelMA為基質(zhì)的3D生物支架中新生軟骨形成的潛力。通過標準化定量超聲成像（SQUI）方法與批量輪廓掃描的結(jié)合，以及3D圖像渲染技術(shù)，可實現(xiàn)生物支架相關(guān)軟骨新生形態(tài)和理化性能改變的監(jiān)測。
文獻來源：https://doi.org/10.1016/j.actbio.2022.05.037
