2023年11月6日，FDA國家毒理學研究中心Weida Tong等人在nature communication上發表名為《A generative adversarial network model alternative to animal studies for clinical pathology assessment》的文章，旨在討論利用生成對抗網絡（generative adversarial network,GAN）模型代替動物實驗用于臨床病理學評估。
背景
在生物醫學科學領域中，動物實驗對于理解疾病進展、發現預后/診斷生物標志物、風險和安全性評估以及開發新治療方案至關重要。盡管動物實驗提供了與臨床實踐相似的多維信息，但當前關注已從傳統的動物實驗轉向評估藥物在人體中的應用安全性。FDA現代化法案2.0強調了探索新方案的需求，而新方案支持動物實驗的替代、減少和改進（replacement，reduction，refinement，即3R原則）。
人工智能（Artificial Intelligence, AI）技術在許多領域日益革新，毒理學中的 AI發展很有可能找到支持3R的風險評估替代方法。毒理學中的大多數AI主要用于分析和處理數據來識別模式并進行預測，如定量構效關系（QSARs）。這些方法常側重于毒理學效應的籠統概念（如毒性或非毒性）的單一終點。相反，基于動物的毒性評價提供更豐富、多維的信息，包括毒素基因組學和臨床病理學信息，來支持風險評估和決策。
近來，生成式AI獲得了很多關注，如chatGPT。生成式AI如GAN可以創造新的內容，通過學習傳統的動物實驗結果來生成未檢測化合物的動物數據從而提供一種代替動物實驗的方法。作者報告了一種用GAN方法開發的生成式AI叫做AnimalGAN，用于動物實驗。AnimalGAN能夠模擬虛擬的動物實驗生成類似于傳統動物實驗的多維數據。具體而言，AnimalGAN利用傳統的動物實驗數據，建立藥物暴露（藥物、藥物劑量和暴露持續時間結合）與臨床病理學發現（如臨床化學和血液學指標）的聯系來生成未檢測的新藥在預定劑量和治療時間內的臨床病理學概況。
作者證明了即使未檢測新藥與訓練集的藥物在化學結構、藥物類別、FDA批準的年份顯著不同的情況下，仍表現出顯著的穩健性。相比傳統的毒理學計算方法，AnimalGAN在預測臨床病理學指標方面優于12種傳統定量構效關系方法（QSAR）。此外，在評估藥物的肝臟毒性方面，AnimalGAN結果與動物實驗相當。在3R科學中，最關鍵的爭論之一是動物實驗并不總是能夠準確預測復雜情況下（如特殊藥物引起的肝損傷）的人類結果。然而，該研究人員發現，AnimalGAN通過無限次實驗（資源允許的情況下）可以對不同個體動物的臨床病理數據進行群體的近似估計，這有可能發現傳統動物實驗不太可能識別的罕見毒理學事件從而改善動物研究向人類結果的轉化。
結果
AnimalGAN的開發
在當前的研究中，AnimalGAN生成了38種臨床病理學指標，其中測試化合物用化學描述符表示，研究條件包括治療持續時間（3天、7天、14天和28天）和劑量組（高、中、低）。
AnimalGAN模型是在來自Open Toxicogenomics Project-Genomics Assisted Toxicity Evaluation Systems（TG-GATEs）數據庫的6442只大鼠數據（作為訓練集），對應于1317種治療方案下（包括化合物-劑量-時間的組合）的110種化合物（其中大多數是藥物）進行開發的，采用了混合的生成對抗網絡（GANs）架構（圖1a）。然后相同TG-GATEs數據庫的1636只大鼠數據作為測試集來進行模型評估，測試集包括332種治療方案下的28種不同化合物（圖1b）。
圖1. AnimalGAN模型開發
在測試集中觀察到生成數據和真實的臨床病理學指標之間高度一致性（圖2c均方根誤差RMSE17.58，顯著小于背景對照的中位數72.46，Wilcoxon秩和檢驗p值2.48×10-169）；高余弦相似性（圖2d, 1.00，顯著高于中位背景對照值0.98，Wilcoxon秩和檢驗p值1.45×10-181)。t-SNE（T分布隨機近鄰嵌入）降溫可視化顯示了測試集的生成數據與真實臨床病理學指標之間的高度相似性（圖2e）。
圖2. AnimalGAN模型評價
AnimalGAN方法評估
AnimalGAN方法在訓練/測試集分離策略上有三方面的難點，證明了AnimalGAN用于未檢測藥物結果的可行性和可靠性；測試藥物包括1）化學結構與建模使用的藥物結構完全不同；2）治療類別不在AnimalGAN開發的范圍內，3）相比于構建AnimalGAN模型的藥物，測試藥物最近才獲得FDA批準。在這三種不同的情境中，衍生的AnimalGAN模型在相應的測試集上產生了與原始AnimalGAN模型相同的結果。在三個場景的生成數據和真實數據之間的余弦相似性中位數 > 0.99（顯著高于背景對照的中位數0.98，P < 5.65×10-140），而中位均方根誤差 < 20.18（顯著小于中位背景對照72.46，P < 4.80×10-141）（圖3）。此外，在三種場景中，生成數據和真實數據中38項臨床病理學指標的相關性與原始AnimalGAN模型觀察到的結果相當。作者強調了第一種極端情況，當化合物的結構信息是開發預測模型的唯一輸入時存在一些擔憂，如適用領域和活性懸崖；所謂活性懸崖是指化合物結構中微小的改變會導致生物活性顯著變化。為緩解這些擔憂，將藥物的暴露信息（藥物劑量和治療持續時間）納入模型中確保在真實世界中具有強大的適用性。
圖3. AnimalGAN模型在三種完全不同的真實世界場景的評估
AnimalGAN VS 傳統人工智能
作者比較了AnimalGAN結果與38項臨床病理學指標的每一項QSAR分析進行了比較。對于每項指標，作者采用與AnimalGAN完全相同的試驗設計和輸入（描述符和暴露信息）開發了12個回歸模型。AnimalGAN的預測值與真實值之間的均方誤差比所有QSAR模型對每項臨床病理學指標的預測值與真實值之間的方差小得多。值得注意的是，38項臨床病理學指標的每一項都開發了一個單獨的QSAR模型，而AnimalGAN同時生成38項指標的數據。
AnimalGAN應用
動物數據用于毒理學評估的常見情景是，將治療組的觀察結果與其時間匹配對照組的觀察結果進行比較以確定安全范圍。作者比較了此情景下真實動物實驗數據與AnimalGAN結果，測試集中觀察到高度一致（即96.08% - 100%）。在臨床和臨床前研究的情況下，所預測的38項臨床病理指標中，7項用于肝毒性評估（丙氨酸氨基轉移酶ALT、天冬氨酸氨基轉移酶AST、乳酸脫氫酶LDH、堿性磷酸酶ALP、γ-谷氨酰基轉肽酶GTP、總膽紅素TBIL和直接膽紅素DBIL），另7項用于腎毒性評估（尿素氮BUN、肌酐CRE、鈉、鉀、氯、鈣和無機磷）。基于AnimalGAN的評估與動物研究中肝毒性和腎毒性一致性分別為96.08%-100%和97.89%-100%（圖4），表明AnimalGAN在無動物試驗中的潛在用途。
圖4. AnimalGAN模型毒性評估
毒性評價中DrugMatrix數據的外部驗證
使用DrugMatrix數據集對AnimalGAN進行外部驗證。臨床病理學指標在不同的實驗方案或不同的實驗室之間可能差異很大。為此，作者分析了TG-GATEs和DrugMatrix都測試過的70種常見化合物（對應175種治療情況）的實驗數據，建立實驗設置中的基線一致性。25項常見指標在兩個數據集之間的總體平均一致性是81.20%。對于717種治療方案下的355個化合物，AnimalGAN生成的結果和DrugMatrix的真實數據一致性是82.85%。作者還比較了25項臨床病理學指標基線設置的一致性比較（圖5a）。此外，作者還比較了訓練集中的110個化合物和外部驗證的355個化合物的化學結構，結果顯示重疊并不顯著(圖5b)，表明模型對不同結構的化合物可能具有廣泛的適用性。
圖5. AnimalGAN模型的外部驗證
AnimalGAN預測特異性藥物引起的肝損傷（idiosyncratic drug-induced liver injury, iDILI）
由于AnimalGAN是一個虛擬動物模型，可以模擬許多大鼠的臨床病理分布，其結果可能預測人群中罕見的有害事件，從而將臨床前的發現有效地轉化為臨床實踐。例如，iDILI很少見，即使在臨床試驗后期也無法檢測到，而臨床前的研究更加難以預見。因此，iDILI僅在上市后監測中報告，在美國也是導致藥物撤回和急性肝功能衰竭的主要原因。監測iDILI是藥物警戒中最具挑戰性的領域之一，因為動物和人體研究中有限的樣本量不能夠提供足夠的統計學意義。作者用AnimalGAN進行了一項28天的虛擬研究來生成十萬只大鼠的肝酶數據，這些大鼠分別用troglitazone、pioglitazone和rosiglitazone進行高劑量治療。Thiazolidinediones是一類化學結構相似的家族藥物，用于治療2型糖尿病。其中，Troglitazone由于發生iDILI的頻率和嚴重程度較高而撤市，而pioglitazone和rosiglitazone因為iDILI發生的頻率較小（不到1%）和嚴重程度較輕（大多數是輕度和可逆）。作者通過大量模擬，利用肝酶（傳統用于評估DILI）高于正常上限的大鼠數量來檢驗這三種藥物DILI風險的差異；這些指標分別是ALT、AST和TBIL，ALT和AST評估肝臟受損的程度，而TBIL顯示肝功能的喪失。采用經典的醫學法則（Hy’s Law）將ALT（或AST）與TBIL結合評估臨床環境中藥物誘導性肝損傷的整體風險。Troglitazone組肝酶升高（除ALT外）的大鼠多于其他組的大鼠。此外，就ALT（或AST）與TBIL結合評估的總體DILI風險而言，Troglitazone的DILI頻率比其他兩種藥物高出兩倍多，與實際情況相符。
討論
全球各地正在積極推動無動物實驗的研究，包括FDA現代化法案、FDA預測毒理學路線圖、Tox21計劃以及歐洲的ONTOX。這反映了對計算毒理學，以及取代傳統動物實驗的日益重視。計算毒理學領域長期依賴于類似QSAR的方法，但這些方法通常只能預測籠統概念的單一終點，缺乏關鍵的具體信息。相比之下，基于動物的毒性評估提供了更豐富、多維的信息支持風險評估和決策。
AnimalGAN作為一種生成式AI，致力于模擬生成多維毒理學信息，以更全面地反映傳統臨床前毒理評估。與傳統的QSAR方法相比，AnimalGAN在預測臨床病理學指標方面表現出色。作者使用DrugMatrix數據集進行了AnimalGAN的驗證，雖然存在一些實驗設計上的差異，但AnimalGAN與實驗數據在毒性評估中顯示出大約83%的一致性，證明了其應用潛力。AnimalGAN不僅在預測準確性上具有優勢；相較于QSAR一次只能預測一個終點，AnimalGAN還能一次生成完整的毒理學特征報告。該技術為評估人類種群中罕見的不良事件提供了可能的途徑，從而改善對于藥物安全性的評估。盡管AnimalGAN是一項有潛力的技術，但研究者也強調了AnimalGAN目前的局限性，特別是在化學結構相對有限的情況下。未來的研究可以通過對更廣泛的動物數據進行學習，進一步提高AnimalGAN的穩健性和適用性。
