本文以實例，利用方法開發流程，將高效液相色譜方法開發變簡單，讓新手小白也能輕松掌握液相色譜方法開發能力。
高效液相色譜方法開發通常耗時且費力。大家常采用的方法是，用已經習慣使用的溶劑、pH條件、緩沖鹽、以及常用色譜柱的組合，作為起始條件，然后對流動相的比例進行一系列的調整，直至獲得比較滿意的峰形與分離度。但這樣的工作方式通常極為耗時，而且也并不能獲得最佳分離條件。更為系統性的方法策略，是利用好的實驗設計，并遵循以下流程，進行高效、高質量的反相色譜方法開發。這個方法開發流程包括：方法篩選：流動相pH、有機溶劑、以及色譜柱，作為對選擇性影響最大、因而也是最重要的條件因素，首先被加以篩選。方法優化：對以上得到的所有結果，評估這三個因素的何種組合，獲得了最佳分離效果。在這個組合條件的基礎上，進行優化或微調，以獲得最終想要的結果。方法驗證：對最終的方法進行驗證，檢查它是否滿足預期的分離效果與分析目的。
一、啟動
為了設計一個有效的測試方法摸索試驗，盡可能多地搜集關于樣品和被分析物化學特性的信息是很重要的。
1、方法開發所需信息
-- 樣品溶解性能
被分析物數量？需要分離多少分析對象色譜峰？
-- 化學結構
功能基團？被分析物有何區別？有無可電離基團？電離常數？pH值如何影響色譜分析？
-- 檢測
需要或可能采用何種檢測？被分析物是否有紫外吸收？λmax？
-- 濃度范圍和定量要求
需要多高檢測水平？需要多大定量限？
-- 樣品基質影響
是否有阻礙分離或檢測的基質影響？>>>>
2、方法使用的目的
在開發一種測試方法之前，還需要考慮：是否理解和明確了測試方法的目標和使用目的？清楚理解使用目的將有助于確定必須要滿足的性能參數以及驗證方法所需關鍵參數？例如可能需要從樣品的所有組分中分離一種對象被測物的方法，或者可能需要既能從其它組分中分離對象被測物、也能使所有組分之間能夠相互分離的方法。其它考慮因素可能還包括：需要多大通量？需要多大分辨率？可以接受的拖尾因子等。我們采用帕羅西汀有關物質分析方法開發實例來展示系統策略。
二、方法篩選
1、pH的影響
當分析物含有可電離官能團時（可電離官能團指，在不同的pH條件下可處于不同程度的電離狀態，例如：伯/仲/叔胺基、羧酸基、酚酸基），pH條件將強烈影響分析物的反相保留效果，pH條件的改變也會造成最強烈的選擇性改變效果。酸性和堿性化合物在其未電離狀態下時反相保留最大，中性化合物的保留不受pH影響。
pH是如何影響反相保留性質的？對于可電離化合物，要獲得最強的反相保留，分析物應盡可能的不帶電或電離，此時分析物的極性相對較小，在反相色譜柱上的保留就更強。因此，酸性化合物應使用低pH條件，而堿性化合物更適用高pH條件。中性化合物沒有任何可電離官能團，因此，不會受到pH條件影響。這些點線圖，就好比滴定曲線，與分析物分子pKa值高度相關。在開發方法時，應避免在化合物分子的pKa值附近篩選pH條件，否則，pH值的微小變化都會導致保留和選擇性的劇烈變化。保留曲線的“平臺區”是分析方法耐用性較強的區域。
2、色譜柱的影響
在選擇色譜柱進行分析方法開發時，應充分認識，色譜填料基質(硅膠顆粒、雜化顆粒、聚合物顆粒)因其化學性質不同而會提供不同的保留與選擇效果。
不同的鍵合相，不同的選擇性
疏水性－長的烷基鏈，提供更強的保留
硅羥基活性－影響色譜峰的對稱性和次級相互作用
抗水解穩定性－鍵合相(如C18)通過更多的鍵鍵合到基質顆粒上
官能團的密度－影響載樣量
3、有機溶劑的影響
甲醇和乙腈，是用于反相分離的典型有機溶劑。除了洗脫強度、粘度(與柱背壓有關)、紫外吸收性不同，甲醇與乙腈在化學選擇性上也有所不同，甲醇可以發生氫鍵作用，因此會提供顯著不同的選擇性。
甲醇：洗脫能力較弱、質子化溶劑，提供氫鍵作用
乙腈：非質子化溶劑、洗脫能力較強、粘度較低(柱背壓更低)
有機溶劑相對洗脫強度曲線：
實驗圖譜表明，與乙腈相比，甲醇的洗脫能力較弱，因此所有分析物都獲得了更強的保留。但是，對于這個應用，乙腈提供了更好的分離選擇性。因此，pH 10、色譜柱BEH C18和乙腈的條件組合，就可以用作下一步的優化微調。
三、方法優化
有幾個參數可以用來調整或優化色譜分離效果。梯度斜率是一個用來操作以控制保留和選擇性的物理參數。但是，梯度斜率經常在分離度和靈敏度之間做平衡考量。另外一個可以優化的參數是溫度。每個化學過程都受溫度影響，溫度可以提供明顯的不同選擇性。
1、方法優化與梯度斜率
更緩的梯度斜率可以提高分離度
降低梯度斜率將降低靈敏度
更陡的梯度斜率可能壓縮色譜峰，經常會導致分離度的降低
增加梯度斜率將增加靈敏度
改變梯度斜率時要平衡峰高與分離度的關系
改變保留與選擇性
2、方法優化與溫度
減少流動相粘度
降低背壓
如果流速保持常數，提高分析物的擴散
更高的優化線速度
改變保留與選擇性
溫度會影響中間的每一個化學過程，例如增加溫度會降低移動相的粘度，如果流動速度恒定將導致系統背壓降低，高溫將改變固定相和流動相之間的分配速率，然而由于提高了被測物分散性，會加快優化線性速度。對溫度變化敏感的化合物，溫度的微小變化都會導致選擇性發生獨特變化。
此例子中，溫度以15 ℃的步幅從30 ℃開始上升到40 ℃和60 ℃，隨著色譜柱溫度增加，組分的分離性能改善，另外被測物的分散性提高，譜峰更尖銳，色譜柱溫度為60 ℃時分離效果最佳。
四、分析方法驗證
分析方法驗證經常是由多個步驟組成的反復人工過程，需要進行大量的色譜測試，以充分評估所有八種特性，審視、計算和管理這些過程獲得的所有數據可能具有一定的難度。Empower方法驗證管理器采用自動化的驗證過程，使數據審視更加順暢，極大提高了驗證過程的效率和可靠性。
方法驗證提示
方法驗證用于確認分析方法的特性能否滿足應用要求，驗證過程中需要評估的典型色譜法特性是專屬性、線性、范圍、檢測限、定量限、準確度、精度、穩定性。
五、結論
通過使用包括摸索試驗和驗證的方法可明顯提高色譜測試方法的開發效率。設計試驗研究包括影響選擇性的多個參數，例如固定相、pH值、有機改性劑，自動化運行極大加速了測試方法開發流程。合理審視數據后，完成最終測試方法經常是微調和優化如梯度坡度和溫度等變量的過程。為了保證所開發的方法能夠滿足應用要求，需要使用前面確定的性能參數對方法進行驗證。驗證結果－使用Empower方法驗證管理器對帕羅西汀方法的驗證結果如下：
