摘要
近年來，益生菌類微生態制劑發展迅速，為保證行業正常發展，使益生菌制劑安全有效地為人類健康服務，我國對益生菌制劑的質量標準問題日益關注。益生菌的質量標準是組織益生菌生產和提高產品質量的重要手段，《中華人民共和國藥典》是國家對益生菌制劑實行監督的準繩，也是國家對益生菌制劑生產和質量的要求，與其他藥品種類相比，益生菌等微生態制劑的標準還存在不少差距。2018 年，我國已形成近千億元的益生菌產業及龐大的市場。但在益生菌產業快速發展的過程中，存在益生菌概念使用不當、核心菌株模糊不清、功能性質難以界定等諸多問題，致使益生菌的健康發展存在潛在的隱患和風險。
本文對我國微生態制劑的現狀進行了分析，從品種概況、產品作用機制、標準現狀、循證醫學及臨床風險等多角度出發，對現有益生菌制劑的質量標準體系存在的風險不足加以分析，希望能夠促進相關標準的提高并對行業健康發展有所助益。
關鍵詞
微生態制劑; 益生菌; 質量標準; 循證醫學; 腸道微生物
人體腸道是一個龐大復雜的微生態系統，包括400 ～ 500 種菌種［1］，大約有 1014個微生物［2］。腸道微生物的種群構成及數量比例維持著動態平衡，并通過宿主與微生物之間、微生物與微生物之間的相互作用以及營養分配和物質轉化調控實現。腸道微生物對穩定宿主的生理狀態和抵抗致病菌侵襲具有極其重要的作用。患病宿主腸道菌群的定殖模式、菌群組成、數量、優勢菌群等均發生顯著變化［3］。
微生態制劑( microecological preparation) 是根據微生態學原理，利用對宿主有益的正常微生物或其促進物質制備成的制劑，具有維持或調整宿主腸道微生態平衡、防治疾病和促進宿主健康的作用。隨著微生態學研究的深入，其應用也越來越廣泛。與化學藥物不同，微生態制劑的作用具有明顯的菌株特異性和劑量依賴性［4］。
2018 年，我國已形成近千億元的益生菌產業及龐大的市場。但在產業發展過程中，存在著概念使用不當、核心菌株不明、功能性質難界定等諸多問題，致使益生菌的發展存在潛在的隱患和風險。近年來，為保證行業正常發展，使益生菌為主的微生態制劑安全有效地為人類健康服務，我國對益生菌制劑的開發及質量標準問題日益關注。與其他藥品種類相比，益生菌等微生態制劑的質量標準存在較大差距。基于此，本文將重點針對益生菌為主的我國微生態制劑現狀進行綜述，并對現有益生菌制劑質量標準體系存在的風險不足加以分析，希望能夠促進相關標準的提高并對行業健康發展有所助益。
1、微生態制劑概述
微生態制劑可分為益生菌( probiotic) ［5］、益生元( prebiotic) 和合生元( synbioltic) 3 種［6］。作為目前我國最主要的臨床微生態制劑，益生菌的使用可以追溯到發現微生物之前的歷史階段。
現代益生菌研究的重點是篩選潛在的益生菌菌株并確定其作用機制，以進一步了解菌群的復雜相互作用及其定殖抗性( 抵抗病原菌入侵的能力) ［7］。益生菌研究的迅猛發展從益生菌相關研究成果數量增加上有所反映( 從 2000 年的 176 篇·年 － 1增加到2014 年的 1 476 篇·年 － 1) 。大量的益生菌臨床試驗學術成果使醫療機構和公眾難以確定益生菌與相關疾病的對應關系。隨著用于檢測不可培養微生物的新型技術的出現( 75% ～ 95% 的結腸微生物無法在標準培養基中生長) ，人們對微生態學有了更好的了解和認識［8 － 9］。這些新的技術使研究人員能夠專注于抗生素或慢性疾病等破壞性因素如何改變微生物群落，以及各種益生菌菌株如何糾正或恢復這種平衡［10］。
2001 年，聯合國糧食及農業組織( Food and Agriculture Organization，FAO) 對益生菌進行了重新定義:“益生菌是指那些當使用劑量適量時會對宿主產生健康影響的活體微生物”［11］。2013 年，世界胃腸病學組織( World Gastroenterology Organisation，WGO) 發布了有關益生菌和益生元的全球指南，并確認益生菌的功效具有菌株特異性和劑量特異性［12］。2014年，歐美益生菌行業共識聲明回顧了益生菌的發展，并將臨床益生菌分為安全微生物、膳食補充劑以及益生菌藥物等 3 大類。
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2、微生態制劑作用機制
2． 1 腸道微生物
人體腸道中含有超過 40 萬億的細菌細胞，除細菌外，還包括極少的古生菌、真菌、原生生物以及大量病毒和噬菌體，這些微生物給宿主帶來近 60 萬個腸道微生物基因［12］。在菌種及菌株水平上，宿主微生物群落多樣性是顯著的，這種多樣性是由宿主基因型、宿主出生時通過垂直傳播途徑獲得的初始定殖微生物群落和宿主飲食習慣共同決定的。正常情況下，腸道菌群與宿主之間是共生關系，許多研究顯示，健康人群與患者的定殖微生物群落顯著不同，盡管如此，目前仍不能準確表述健康宿主微生物群落的構成特點。因此，當前益生菌研究的熱點是探索菌群能否促進健康或逆轉疾病狀態［12］。
2． 2 臨床作用機制
益生菌類微生態活菌制劑在臨床使用中預防或治療疾病的作用機制主要包括以下幾個方面［13 － 15］。
2． 2． 1 維持腸道菌群平衡
當機體受到不利因素影響時，菌群間的動態平衡被破壞，導致胃腸道內的需氧菌和厭氧菌比例失衡，此時添加適當的益生菌可以調節菌群比例，對宿主胃腸道功能起調節作用，恢復菌群平衡。
2． 2． 2 生物奪氧理論
當機體處于低氧狀態時，體內需氧菌的繁殖受到抑制，厭氧菌在體內定殖生長，病原微生物的繁殖受到抑制，機體狀況良好。當機體處于富氧狀態時，體內需氧菌大量繁殖，通過吸收利用腸道內的氧促進局部氧分子濃度降低，有利于機體內的厭氧菌例如雙歧桿菌的生長繁殖，從而使機體微生態恢復到平衡狀態。
2． 2． 3 生物拮抗作用
益生菌與腸道內的有益菌群共同拮抗病原微生物，占據腸道的吸附位點，在腸道內定殖，病原微生物沒有吸附位點，無法定殖發揮作用而被機體排出，從而促進有益菌群的優勢種群作用，腸道微生態恢復平衡。
2． 2． 4 合成有益代謝物
益生菌在生長繁殖過程中產生的有機酸能夠促進胃腸道 pH 值降低，形成低酸環境，抑制致病菌的生長繁殖，同時，有機酸對消化液的分泌起促進作用，機體的消化功能得到增強，從而進一步加強機體對營養物質的消化吸收功能，恢復腸道功能。
2． 2． 5 增強機體免疫力
益生菌的細胞壁含有免疫多糖類物質，刺激機體產生干擾素，增強巨噬細胞的活性，調節免疫系統，誘導保護性細胞因子( 如IL-10 和 TGF-β 等) 并抑制炎癥因子( 如 TNF-α) ，增強機體的免疫能力，改善機體的免疫水平［12］。
3、藥用益生菌產品現狀
3． 1 主要產品分類
目前國內用于生產藥用益生菌的微生物約有20 余種，絕大多數菌株與國外不同。這些微生物按菌株來源和作用方式可分為原籍菌、共生菌和真菌［16］。原籍菌來源于人體腸道菌群，可直接補充原籍菌，如雙歧桿菌、乳桿菌、糞鏈球菌等; 共生菌來源于人體腸道菌群外，與人體原籍菌共生并促進原籍菌生長、繁殖或直接發揮作用，如芽孢桿菌、酪酸梭菌、枯草桿菌等; 真菌制劑主要為布拉酵母菌，作用機制獨特。另外，按菌株的生存條件可分為厭氧菌( 雙歧桿菌、乳酸桿菌、梭狀芽孢桿菌等) 、兼性厭氧菌( 大腸桿菌、腸球菌、地衣芽孢桿菌等) 和需氧菌( 枯草芽孢桿菌等) ［15］。
3． 2 《中華人民共和國藥典》收錄品種
《中華人民共和國藥典》2015 年版的微生態活菌制品總論中共收錄 22 種批準上市的微生態制劑，大多數用于預防和治療胃腸道疾病。所采用的菌種主要包括: 保加利亞乳桿菌( Lactobacillus bulgaricus)等 15 種［17］。我國現有藥用益生菌產品以 OTC 藥品為主，部分為雙跨品種［15］。
3． 3 國外益生菌制劑情況
3． 3． 1 美國
益生菌僅作為膳食補充劑、功能性食品、醫療食品和非處方藥品，產品上市前需通過安全認證認可( generally recognized as safe，GRAS) ，通過GRAS 后上市前無需 FDA 批準，不能有臨床應用導向，暫無上市的益生菌藥品［18］。
3． 3． 2 日本
1990 年確立了特殊健康食品管理級別，由于保健成本上升等因素，日本撤銷了部分OTC 類益生菌藥品以降低醫療保險費用，但是有完善安全記錄的此類藥品可以作為準藥物或功能性保健食品進入市場。
3． 3． 3 歐洲
各國均有益生菌功能性食品的管理標準。挪威食品科學安全委員會于 2009 年出臺了病患應用益生菌制劑的評價法規，嚴格規定益生菌制劑不允許用于處于疾病臨界狀態的患者。荷蘭和瑞典專門為含益生菌特定產品的健康聲明建立了可追溯的科學檔案。澳大利亞和新西蘭將益生菌產品列入非傳統食品范疇中的新型食品，需要對其進行公共健康和安全性評價［15］。
4、用益生菌質量標準現狀
4． 1 國內標準
我國批準上市的微生態活菌制品涉及中藥、化學藥品、保健藥品和生物制品 4 類，共計 50 個品類、95 個文號。《中華人民共和國藥典》2015 年版三部微生態活菌制品總論共收載 22 個品種，15 種微生物。分類為生物制品的微生態活菌制劑執行《中華人民共和國藥典》2015 年版三部要求，在菌種管理、菌種鑒定、含量測定、雜菌檢查方面的標準較為全面［19］。分類為保健藥品、中藥和化學藥的微生態活菌制品標準大多為地標轉國標或者新藥轉正標準，標準來源不明，年代較早，對生產管理控制和檢定方法的要求都很滯后。
由于標準體系不一致，導致相同產品質量水平存在較大差異，相同品種的菌株來源也不盡相同。菌種是微生態活菌制劑的核心，菌種的穩定性和純度決定了微生態活菌制劑的藥效和安全性，現行地標轉國標或者新藥轉正標準在菌種鑒定方面存在極大隱患。
4． 2 國外標準
美國藥典 USP43-NF38 中收錄的通則〈64〉益生菌中，除活菌計數、污染檢查等常規項目外，還包含特征鑒定項，采用的方法是 PCR 法。目前該通則僅包含乳酸菌和雙歧桿菌兩大類微生物的 PCR 特征鑒定，根據其說明，其他菌種的特征鑒定將陸續加入該通則。相比于《中華人民共和國藥典》2015 年版，USP43-NF38 加入了 PCR 等分子生物學方法，實現了更加嚴格的益生菌菌種控制。歐洲藥典 EP 10． 0 益生菌部分的特征鑒定采用宏觀法、微觀法、生化測試法以及分子遺傳學、高通量測序等方法完成，最終實現菌種到株水平的鑒定。由于歐洲藥典并沒有嚴格控制方法來源，這為特殊產品菌種鑒定方法的使用提供了便利。無疑，歐洲藥典在菌種控制及穩定方面相較美國藥典 USP43-NF38 和《中華人民共和國藥典》2015 年版更為嚴格。
4． 3 質量標準不足與缺陷
菌種和菌株是微生態制劑的核心，以國務院《病原微生物實驗室生物安全管理條例》［20］為基礎，參考《人間傳染的病原微生物名錄》的分類原則，按照對人體危害程度可將菌種分為 4 類［19］。《中華人民共和國藥典》2015 年版收錄的微生態活菌制劑中，腸球菌等條件致病菌與芽胞類活菌制劑的生產菌株為第 3 類，具有條件致病性，存在一定風險; 其他活菌制劑菌種為第 4 類，通常情況下認為安全可用［21］。
影響藥用益生菌發揮功效的因素有很多，包括制劑的制備方法、貯藏條件、菌種配伍方式、腸道菌群狀態、使用劑量和方法、宿主個體差異、菌群存活率等。開發合格有效的益生菌臨床制劑應綜合考慮以下 3 類影響因素: ① 菌株因素: 菌株必須保證無毒、無害、無不良反應，菌株必須具有傳代穩定性，菌株需具有耐受胃酸、膽汁酸等定殖環境因素的能力，菌株必須具有黏附性，產乳酸菌株要有較強的抗胃酸能力及產生抗菌活性物質的能力等。② 宿主因素: 宿主腸道內的微生物菌群對制劑在宿主腸道中發揮作用具有多方面的影響。通常宿主腸道的正常菌群對外來菌群具有強烈的定殖抗性，作為非宿主原有正常菌群成員的益生菌類微生態制劑很難在宿主腸道中黏附定殖。如果宿主處于菌群失調狀態，制劑就很容易發揮其作用，效果更加明顯。③ 其他因素: 生產工藝條件對制劑發揮功效具有很大影響，如菌株在發酵時的生長條件以及發酵結束的時間等都會影響菌體的存活率。同一初始菌株，由于發酵條件不同，其終端代謝產物不同，作為制劑的作用效果也會有很大不同。另外，產品劑型及發酵技術也會影響產品的功效。
目前對藥用益生菌的菌株選擇、配伍、安全性、有效性和使用規范等方面都還沒有相對統一的技術標準和指導原則，一方面是因為理論研究落后于實際應用，即使是應用歷史很長的益生菌類微生態制劑，其作用機理仍然不完全清楚; 另一方面是由于必要的技術方法不完善，相關臨床證據及試驗數據不足等。作為臨床用藥，現有大多數市售益生菌制劑并沒有充分的臨床試驗證實其安全性、有效性和處方合理性等關鍵屬性，對于如何正確評價益生菌類微生態制劑的作用效果還需要進行深入的研究。
5、循證醫學分析及臨床風險
5． 1 循證醫學證據及等級
循證醫學( evidence-based medicine，EBM) 又稱實證醫學，其核心思想是醫療決策( 即患者的處理、治療指南和醫療政策的制定等) 應在現有最好的臨床研究依據基礎上作出，同時也重視結合個人的臨床經驗。傳統醫學以經驗醫學為主，即根據非實驗性的臨床經驗、臨床資料和對疾病基礎知識的理解來診治患者。循證醫學并非要取代臨床技能、臨床經驗、臨床資料和醫學專業知識，它只是強調任何醫療決策應建立在最佳科學研究證據基礎上［22］。臨床研究依據按其科學性和可靠程度大體可分為 4 ～5 級［23］。
目前，大多數國內藥用益生菌產品在上市前均沒有循證醫學數據報告( 表 1) 。對涉及益生菌的循證數據進行了統計研究。
5． 2 臨床風險分析
抗生素應用導致的微生物群落失衡在很大程度上推動了益生菌的臨床治療應用［24］。在未提及諸如處方、功效和安全性等參數的情況下，大多數益生菌制劑沒有經過嚴格的臨床試驗。寬松的標準導致在不同的國家和地區出現大量未經臨床循證證實的益生菌制劑。直到近年，多個國家出現的益生菌制劑問題才使益生菌的安全性特征與高風險人群的相關性等問題引起足夠的關注。
盡管許多研究都認為益生菌對健康具有顯著的促進作用，但實際上，除了特定菌株明確具有循證醫學證據證明其具有促進健康的作用，大多數益生菌及其制劑的情況要復雜得多。除益生菌所含菌種的劑量和功效外［25］，還必須全面研究宿主的免疫反應才能更好地了解和使用益生菌。目前的普遍觀點認為益生菌是絕對安全且有效的，這是一個值得擔憂的問題。
FAO 和 WHO 聯合評估益生菌指南報告［11］指出益生菌的 4 種特定類型不良反應包括益生菌給藥引起的微生物易位感染［26 － 29］、部分益生菌代謝產物引起敏感人群產生的代謝紊亂及過敏反應［30 － 32］、易感個體過度免疫刺激引起的瘙癢性濕疹等［33 － 35］以及毒性基因及耐藥基因轉移導致的其他不良反應［36 － 38］。盡管支持益生菌安全性的研究遠遠超過了其風險的相關研究，但顯然并未反映出益生菌安全性的整體情況。
6、質量標準制修訂建議
6． 1 益生菌制劑共識
益生菌的核心特征是足夠數量、活菌狀態以及有益健康功能。2014 年，由國際益生菌與益生元科學聯合會( ISAPP) 發布的關于益生菌的共識中也突出強調了益生菌的這 3 個核心特征。益生菌的定義也得到了歐洲食品與飼料菌種協會( EFFCA) 、加拿大衛生部( Health Canada) 、世界胃腸病學組織( WGO) 和歐洲食品安全局( EFSA) 等相關組織和機構的認可。益生菌的功效發揮應以活菌為先決條件。益生菌的功能應建立在科學嚴謹的臨床試驗評價和循證醫學證據基礎上，體外實驗與人體完全不同，其結果不能全面反映益生菌的作用，動物實驗可以作為參考，但需要更深入全面的人體或臨床試驗予以確認［39］。
研究人員發現益生菌的定殖抑制了胃腸道固有微生物菌群和腸道基因恢復到正常狀態。益生菌胃腸道的成功定殖與否將決定其是否會影響其人體固有微生物以及腸道基因表達情況。然而研究發現，大部分健康志愿者的胃腸道會抵抗益生菌的定殖，這提示益生菌補充劑并不適用于所有人，在抗生素使用后服用益生菌有潛在的不良反應，甚至可能帶來長期的不良后果。目前使用的一刀切的益生菌制劑和治療范例應該被一種結合科學、測量和技術的定制療法所取代［40 － 41］。
6． 2 益生菌制劑風險
不同國家在藥品安全方面持有不同政策。無論采取何種政策，益生菌高危人群始終存在與使用益生菌有關的風險［42 － 43］。益生菌的配方、劑量和管理模式的變化可能會極大地影響宿主的預防及治療效果［44］。通常從土壤等生態位中篩選出的潛在益生菌與人類腸道內源性生態位顯著不同，使用后，腸道微環境和免疫因子可能會對益生菌菌株施加選擇壓力并激活潛在的毒力因子［45 － 46］。在生產中，益生菌經常與海藻酸鈉混合并在氯化鈣溶液中塑形［47］，因此，應預防膠囊激發宿主的免疫系統以及制劑輔料觸發相關酶活性等導致的健康風險。另外，應嚴格監管益生菌的制造、標記和配送［48 － 49］。
在大量報道益生菌積極效果時，其負面影響已被完全忽略。例如，益生菌大腸桿菌 NISSLE 1917可能會緩解慢性炎癥性腸病和結腸炎，然而，該菌株還可以通過肽聚酮化合物的修飾和宿主細胞因子的調控誘導遺傳毒性［50］。該研究表明，與其他藥物一樣，即使證明功效明顯的益生菌也可能具有不良反應，“宿主微環境”是決定益生菌致病性或條件致病性的重要條件。
6． 3 理想益生菌特性
綜合考慮，理想益生菌制劑應具有的特性應至少包含以下 5 點: ① 可在目標器官或組織( 包括腸道、皮膚表面、口腔、陰道或尿道等) 中存活。② 與宿主系統相互作用。③ 具有抗病或健康促進作用。④ 宿主安全性風險低。⑤ 制造及使用的便利性等［51］。一般情況下，益生菌菌株不應受到與益生菌同時服用的藥物或抗生素的影響。例如，由于僅受抗真菌藥物的影響，而不受抗生素的影響，含布爾酵母( Saccharomyces boulardii) 類益生菌可以與口服抗生素同時服用［35］。益生菌還應具有良好的安全性檔案，應證明益生菌缺乏從靶器官轉移的能力，沒有致病機理，并且幾乎不會引起嚴重的不良反應。另外，還需要證明包括生產復雜程度、菌株批次穩定性、長期穩定性和其他常見的存儲條件穩定性等信息。
6． 4 質量標準制修訂的重點
確定一個合格的益生菌制劑所應具備的質量標準是推動益生菌研制和發展的極其重要的方面［51］。綜合以上分析，新時期益生菌類微生態制劑的質量標準應至少包含并不限于以下內容。
6． 4． 1 菌種鑒定
市售益生菌類微生態制劑多數為野生菌株或經馴化培育的菌株，在傳代過程中會發生變異甚至出現耐藥性［52］。用于生產的菌種應標明所用菌種的屬、種、菌株及菌號等詳細信息，同時還應具有國家有關部門的菌種鑒定書。
6． 4． 2 菌種安全
目前益生菌大多缺乏科學的分子生物學檢查及鑒定，應在標準中適當考慮采用分子生物學的方法研究菌株遺傳背景，確定基因組中是否具有耐藥及毒力因子基因的存在［53］，并建立快速篩查方法確保菌株的安全性和傳代穩定性［54］。
6． 4． 3 活菌數量
活菌數量是評價產品質量的關鍵指標。目前對益生菌類微生態制劑活菌的檢測多采用培養計數法，應考慮菌種的靶器官環境因素等，通過建立合理的體外模型，更加有效地研究菌種在目的環境中的存活率、穩定性等。
6． 4． 4 菌種配伍
在早期的產品開發過程中并沒有關注菌種的配伍關系及分子層面的相互作用關系，由于多菌種益生菌制劑配方的特殊性，在菌株層面單獨開展研究并不能說明關于整體配方的任何問題，故而每個復合配方都應在配方層面進行整體性研究。腸球菌屬微生物致病性、耐藥較強，且可傳播耐藥性，故含腸球菌菌株的益生菌藥物更應引起業界重視，FAO/WHO 已建議益生菌中不宜使用腸球菌［19，55 － 56］。
6． 4． 5 劑型選擇
外源性微生物能否在腸道黏附后定殖，應作為其效果的重要指標。給藥途徑和劑型等因素對此影響極大，到達靶器官的微生物數量和活性均會被嚴苛的體內條件影響，因此，益生菌標準應關注合理的給藥途徑，開發新的劑型和使用方法［52，55 － 56］。
我國微生態學還處于發展階段，微生態制劑自然也處于不很完善的“初級階段”。活菌的種類及其數量是益生菌類微生態制劑的靈魂，與其從外界補入數量不大、不能定殖的非原籍菌，不如創造條件去促進原籍益生菌迅速生長繁殖，以促進微生態平衡［57］。另外，應該盡快完善法規標準，規范醫藥類益生菌的研制、生產、營銷、宣傳和使用行為，通過嚴格執法保證行業的健康發展。
