隨著過氧化氫滅菌技術在生物制藥廠房等高潔凈場所的應用，使用過氧化氫進行隔離器和潔凈空間進行滅菌的過程、驗證方法及關鍵控制點非常重要。因此，過氧化氫蒸汽滅菌技術的優缺點成為生物制藥廠房潔凈區滅菌方式的選擇必須思考的關鍵要素。
生物制藥對潔凈區的空間滅菌效力要求很高，至少需具備以下5點要求：
(1)使用及操作簡單方便，不會對人員和環境造成危害；
(2)殺菌效力需達到2020年版《藥典》規定的滅菌標準，即能夠對枯草芽孢桿菌和嗜熱芽孢桿菌達到104～106的致死率；
(3)材料兼容性好，不會對潔凈區內的設備、彩鋼板、環氧樹脂地面、高效送風口、回風口、玻璃等造成破壞；
(4)無殘留，即滅菌后的消毒滅菌劑殘留不會對藥品構成任何形式的污染；
(5)擴散性好，能夠擴散至被滅菌環境內的各個方位，不會留有死角〔1，2〕。
制藥廠房傳統的滅菌方法主要包括消毒液擦拭法、紫外燈照射法、甲醛熏蒸滅菌技術、臭氧滅菌〔3－5〕等，這些方法存在可重復性差、難于驗證、破壞性大、需消耗大量的人力，以及會危害作業人員的身體健康等缺點〔6－8〕。為解決上述問題，近年來引入了汽化過氧化氫蒸汽滅菌技術，依據相關法規要求，均需要對使用過氧化氫滅菌技術進行滅菌效果的驗證，為生物制藥潔凈區流程化、標準化的滅菌方法提供指導和幫助。
1.1技術背景
在當今制藥工業中，過氧化氫已逐漸取代傳統的滅菌方式，成為表面或空間消毒及滅菌的常用方法，過氧化氫由水和氧氣組成，兩者均很安全，由于氫鍵作用產生“黏滯分子”，導致過氧化氫蒸汽不易擴散，這對滅菌過程中的汽體分布可能會產生一定的挑戰〔9〕。滅菌過程中過氧化氫汽體的較差擴散性可能會對使用的安全性造成一定的影響，因為泄漏的汽體更傾向于“懸停”在泄漏地點，若無外力作用不易擴散〔10〕。因此需要提供額外的動能促進汽體擴散，常見的做法是采用噴射嘴等。
1.2技術特點〔11〕
1．2．1安全
使用蒸汽滅菌，在整個滅菌過程中限制人員進入，若滅菌失敗可安全復原。
1．2．2可靠
通過汽化過氧化氫滅菌處理，可以使得密封屏障內空氣與表面殺菌對數值達到4～6，整個滅菌過程簡單可靠〔12〕。
1．2．3智能化
能夠實現與建筑設施一體化，與BMS實現控制一體化，整個消毒過程可更換操作人員，降低對操作人員依賴性。
1．2．4標準化
將過氧化氫滅菌技術與空調系統結合，能夠有效避免傳統滅菌方式難以標準化、驗證困難等問題〔13〕。目前，制藥廠房中常見的過氧化氫消毒方式主要包括汽化過氧化氫、氣源式霧化過氧化氫和電源式霧化過氧化氫滅菌(表1)。
表1 3種過氧化氫消毒方式比較
1.3技術方式
通過高溫閃蒸將過氧化氫液體汽化成過氧化氫氣體，經高速氣流噴射到滅菌空間中，當高溫飽和過氧化氫蒸汽接觸到較冷的被消毒物品表面時，會形成不可見的微冷凝，通過釋放的強氧化自由基(羥基)來攻擊病原微生物(破壞細胞膜、脂類、蛋白質和DNA)，自由基可對微生物達到log 6的快速殺滅效果〔14〕。滅菌完成后，汽化過氧化氫滅菌設備會自動將環境中的過氧化氫分子分解為水蒸氣和氧氣，當空間內過氧化氫濃度降至1 ppm以下時，人員方可重新進入潔凈區。
汽化過氧化氫滅菌方式包括“干法滅菌”和“濕法滅菌”，兩者均可對微生物的殺滅率達到log 6，主要的區別為干燥劑的使用和對濕度的依賴性不同，“濕法滅菌”主要目的是將氣體達到微冷凝狀態，D值一般為1．08min，在整個滅菌過程無須對滅菌的空間進行除濕，對空間的溫濕度要求也不是很高; 而“干法滅菌”則需要通過降低空間的濕度，增加過氧化氫的濃度來殺滅細菌，整個運行過程需要對滅菌空間進行除濕，濕度一般要求控制在30% 以下〔15，16〕。隨著新版GMP的實施和推廣，我國對無菌藥品的生產提出了更高的要求，尤其是隨著生物制劑的快速發展，一次性使用系統技術越來越得到廣泛應用，廠房布局也越來越靈活，空間滅菌一直是生物制藥生產過程中的關鍵環節，為提高產品質量，選擇合適的滅菌方式就顯得非常重要。在多種滅菌方式中，大多數公司都會選擇“干法過氧化氫滅菌”，其對生物指示劑——嗜熱脂肪芽孢桿菌的殺滅率能夠達到log 6，成為抗體、CAＲ-T、干細胞等生物領域凈化的新選擇。
1.4注意事項
在使用過氧化氫滅菌技術對廠房進行滅菌的過程中，需要注意的問題有5點：
(1)工作暴露濃度為1 ppm，不可超過8 h。
(2) 短期暴露濃度為2 ppm，不可超過15 h。
(3) 危險濃度為75 ppm。
(4) 過氧化氫有親水性，接觸到眼睛或喉嚨時可能會造成呼吸困難甚至導致休克; 接觸到皮膚會氧化皮膚產生白斑，但用水清洗，一段時間后，皮膚會自然恢復。目前尚無報道顯示嚴重事故，出現事故的原因大多是由于操作人員缺乏了解造成的。
(5) 防漏是過氧化氫凈化和環境控制的重要要求，過氧化氫的低擴散性可降低人員暴露其下的危險。高擴散性氣體(如甲醛和二氧化碳) 會增加操作人員暴露其下的危險；防止蒸汽冷凝，此控制點與氣體擴散性同樣重要，可減少過氧化氫在到達目標區域(空間表面)時管路內的損失，在此過程中溫度是非常重要的因素。
2、消毒設備需要考慮的要素
2.1消毒效果的衡量評估
對于制藥企業而言，潔凈區的級別不同，消毒要求則不同。若為B級區，則必須采用106的嗜熱脂肪桿菌芽孢作為生物挑戰菌來評定消毒效果〔17〕。
2.2腐蝕性的評估
主要是針對彩鋼板、鍍鋅板易于氧化材料的腐蝕性評價。
2.3消毒過程衡量和評估
使用過氧化氫蒸汽進行消毒滅菌有一些值得關注的缺陷存在，一款合適的過氧化氫消毒設備，必需兼顧消毒效果和腐蝕性。
2．3．1處理過程及時間
整個滅菌過程需要的時間，包括通風排殘時間在內，即需要多久的時間才能達到符合驗證標準的1 ppm以下過氧化氫含量標準，而不是簡單的關注消毒滅菌時間。
2．3．2準備時間
應考慮是否需要對環境區域進行降溫，部分企業及設備對溫度有所要求，需降低到20℃以內; 是否需要降低濕度，最低的工作濕度要求是多少，這些都將是企業的隱形成本考慮，并且最終會直接歸屬于停產時間。
2．3．3過氧化氫凝聚與擴散
汽化過氧化氫產生凝聚，凝聚液是造成腐蝕性的決定因素，此因素會直接決定腐蝕性的嚴重程度。能直接觀察到過氧化氫汽霧，這是能直接可見的擴散狀況。
2．3．4起泡現象
金屬表面薄油漆涂層在修復/噴涂的表面，由于表面多孔滲水導致過氧化物的吸附，基底物反應后產生的氧氣無法以足夠的速度擴散出去，若涂層表面黏結不緊密，則可能會產生“氧氣泡”。如生物制藥廠房在使用過氧化氫滅菌設備對灌裝軋蓋間進行滅菌效果的驗證時，因使用不同濃度的過氧化氫對潔凈空間滅菌效果進行驗證，連續多次對該區域進行滅菌，導致補修后的彩鋼板涂層表面出現“氧氣泡”，受到腐蝕。因此，在選擇使用過氧化氫滅菌設備時在數個月內運行幾百次循環后，需關注是否會對空間區域內的電子設備造成損害，電線有無損害，不銹鋼是否受影響，有涂層的低碳鋼有無變化，以及暴露的印刷電路板有無損壞等。
2.4過氧化氫蒸汽滅菌實例介紹及驗證
現以某企業廠房潔凈區汽化過氧化氫滅菌系統及隔離器灌裝線為例，簡單介紹滅菌過程、關鍵控制點、驗證注意事項及最終驗證結果。
2．4．1潔凈空間滅菌系統的驗證
(1)驗證前期準備工作: 當驗證方案確認完畢后，需按照既定的配方和劑量配制消毒液，過氧化氫溶液使用量需根據房間大小計算。在滅菌前，應當確保被滅菌空間表面無明顯污物，且表面干燥，應避免房間內高溫，同時對指示劑進行編號和布局，在測試開始之前將所有指示劑布置到其對應的位置。當設備和指示劑布置到位后，需用膠帶密封門縫等可能的泄漏點。
(2)生物和化學指示劑測試：需進行滅菌效果測試，即生物指示劑測試(BI測試)和滅菌均勻性測試，即化學指示劑測試(CI測試)，生物指示劑一般選擇最耐受過氧化氫的嗜熱芽孢脂肪桿菌(106)作為挑戰菌種進行驗證，滅菌結束后在超凈臺或生物安全柜內將生物指示劑放入胰酪大豆胨液體培養基中，培養結束后觀察結果，陽性對照組應呈黃色，陰性對照組應呈紫色，試驗組也呈紫色時，則說明實現了對潔凈空間log 6的滅菌效果〔18－20〕。完成測試后，將所有指示劑收齊并拍照存檔，通過分析化學指示劑，判斷滅菌過程的均勻性結果；將生物指示劑進行7×24 h的培養，通過生物指示劑的培養結果確定滅菌的結果。譬如，確定好過氧化氫蒸汽滅菌設備位置后，用膠帶將房間門縫和軋蓋出料段處門縫封好，保持房間密封性，將溫度控制在10～40℃，濕度控制在15%～80%，將空調關閉后開始驗證過程，最終發現所有監測點的化學指示膠帶上所印刷的字母均在接觸過氧化氫氣體后變色；試驗組中接種生物指示劑的TSB 培養基均未長菌(未出現渾濁)，陽性對照管有菌生長(出現渾濁)，陰性對照管無菌生長，判定消毒合格。當某房間內體積為190 m3，最終得到的滅菌條件為過氧化氫用量1140 mL(折合6000mg/m3)，氣體注入速率為8000 mg/min，過氧化氫汽體注入速率為4000 mg/min。
2．4．2隔離器汽化過氧化氫系統滅菌效果驗證
利用汽化過氧化氫在生產前對隔離器灌裝線進行滅菌是目前生物制藥行業中常見的一種滅菌方式。此部分以某公司的西林瓶灌裝線隔離器集成汽化過氧化氫滅菌系統為例簡單闡述滅菌過程，分為四個階段：
(1)預處理階段。在此階段內，需對待滅菌的隔離系統的內部空間進行除濕操作，隔離器系統配有空氣處理系統，通過空氣處理系統的冷卻及加熱單元對隔離器內部進行除濕操作；同時，加熱單元會開啟加熱操作，當溫度和濕度達到設定目標值后，系統自動停止此階段。在此過程中，過氧化氫溶液進液操作尚未進行。此階段的關鍵參數是空氣溫度和濕度，這兩個參數將會直接影響滅菌循環的可重復性。腔體內部的相對濕度應低于設定值，便于腔體內部空氣對過氧化氫汽體的吸收；腔體內部的過氧化氫汽體會實時分解，溫度越高，實時分解的速率越快。表面溫度過高，可能會干擾點位的微冷凝效果。
(2)充氣階段。在此階段中，過氧化氫溶液將會持續注入并連續運行，通過加熱汽化單元產生過氧化氫汽體，之后在循環風機的作用下通過高效過濾器持續注入至艙體內部空間，此時艙體內部的溫度會略有上升，相對濕度也會穩定快速上升。張少梅等通過研究發現，汽化過氧化氫對高效過濾器是兼容的，可以選用鋁制框架、玻璃纖維介質的高效過濾器，同時需確保高效過濾器所使用的密封膠為硅膠〔21，22〕。當達到設定充氣時間后，充氣階段結束。此階段的關鍵工藝參數是初始過氧化氫的重量，此參數將會影響系統是否能夠達到所需的微生物殺滅速率。
(3)滅菌階段。在此階段，過氧化氫將會繼續蒸發，并且維持在設定的濃度，當達到滅菌時間后，此階段結束。滅菌階段的關鍵參數有兩個，包括過氧化氫注入速率和滅菌時間，過氧化氫注入速率將會影響系統是否能夠維持在充氣階段已達到的微生物殺滅速率，滅菌時間將會影響系統是否能夠達到所要求的總的目標微生物殺滅效力。
(4)通風排殘階段。在此階段，隔離器腔體內部高濃度的過氧化氫通過高通量的新風置換及集成的催化分解單元消除。當過氧化氫濃度達到預設值后停止，一般設定的目標濃度為1 ppm。此階段的關鍵參數是通風排殘時間，使腔體內殘留的過氧化氫符合可接受標準(即過氧化氫濃度＜1 ppm)。某企業對隔離器過氧化氫滅菌開發工藝進行驗證，選出艙體內部的最難點進行生物指示劑和化學指示劑測試后，得到最優條件，詳見表2。
表2 某企業隔離器過氧化氫滅菌工藝驗證條件
3、小結
目前，過氧化氫滅菌技術在生物制藥廠房中的應用已相對成熟，具有很好的可重復性，易于驗證，并且不會對潔凈區內的設備造成損壞，出于成本的考量，過氧化氫干法和濕法滅菌應用較為廣泛。若選擇“過氧化氫濕法滅菌技術”，需考慮如何與空調系統相結合，一般用于較小的空間或隔離器內，采用集成式滅菌系統；而使用“過氧化氫干法滅菌技術”一般用于空間較大的潔凈區，需考慮對溫濕度的控制，同時在廠房建設前期需注意彩鋼板的材質選擇。移動式過氧化氫滅菌系統的應用較為廣泛，因其具有靈便性，可滿足緊急滅菌需求，且其可靈活地應對滅菌區域的布局及功能性房間的變動和改造。展望前景，過氧化氫消毒滅菌方式定會更加普及應用，幫助制藥廠房更安全高效地生產出合格的藥品。
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本文作者陳蘇婉，聯亞藥(揚州) 生物醫藥有限公司，來源于中國消毒學雜志，僅供交流學習。
