依那普利是臨床上常用的血管緊張素轉換酶抑制劑，用于各種原發性高血壓、腎性高血壓、充血性心力衰竭。原料藥主要以馬來酸依那普利的形式存在，原料存在的主要雜質為依那普利拉（雜質Ⅰ）和依那普利雙酮（雜質Ⅱ），其中主要是雜質Ⅰ。
本文擬以歐洲藥典的方法為基礎，對其進行色譜條件優化，進行雜質定量測定方法的驗證，以期為雜質Ⅰ提供可靠的定量檢測方法，同時為該類方法的驗證提供更加科學全面的驗證參數。
1、 儀器和試藥
1.1 儀器
XP205DR電子天平；2臺島津LC20A液相色譜儀；Mili-QIntegrals超純水系統；酸度計；KQ-300DV型數控超聲波清洗儀。
1.2 試劑和試藥
對照品：馬來酸依那普利（批號100705-201604，含量99.9%）、依那普利拉（雜質Ⅰ）（批號2016-784，含量88.1%）。
樣品：馬來酸依那普利原料（批號5113-6-015）。
試劑：磷酸（分析純，批號20171026）；磷酸二氫鉀（分析純，批號20161208；乙腈（色譜級，批號171011）；甲醇（色譜級，批號163201）。
2、 流動相及其他溶液的配制
2.1 流動相及溶劑
緩沖液：稱取磷酸二氫鉀5.4g，加水制成1000mL，用磷酸調節pH至3.0；溶劑1：緩沖液-乙腈-甲醇（1∶2∶2）；溶劑2：溶劑1-緩沖液（8∶92）；流動相A：溶劑1-緩沖液（1∶9）；流動相B：乙腈。
2.2 供試品儲備液
精密稱取馬來酸依那普利原料適量，置50mL量瓶中，加甲醇10mL，加溶劑2稀釋至刻度，制成20mg·mL-1的供試品儲備液。
2.3 對照品溶液
精密稱取依那普利拉對照品適量，置20mL量瓶中，加甲醇2mL，加溶劑2稀釋至刻度，制成1mg·mL-1的對照品儲備液。分別精密量取對照品儲備液1、2和3mL至100mL量瓶中，加溶劑2稀釋至刻度，分別制成質量濃度為10、20和30μg·mL-1的對照品溶液。
2.4 混合對照品溶液
精密稱取馬來酸依那普利對照品和依那普利拉對照品至10mL量瓶中，加甲醇2mL，加溶劑2稀釋至刻度。精密量取1mL至100mL量瓶中，加溶劑2稀釋至刻度，制成20μg·mL-1的混合對照品溶液。
3、 色譜條件及測定方法
3.1 色譜條件
采用ShiseidoC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），柱溫65℃，進樣器溫度4℃，進樣量20μL，流動相同“2.1”項，梯度洗脫，洗脫順序見表1，流速1mL·min-1，檢測波長210nm。
3.2 測定法
精密稱取馬來酸依那普利適量，加甲醇2mL，加溶劑2稀釋至刻度，制成每1mL中約含2mg的溶液，作為供試品溶液，精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取依那普利拉對照品適量，精密稱定，加甲醇6mL，加溶劑2制成每1mL約含6μg·mL-1的對照品溶液，同法測定，按外標法計算含量，依那普利拉的含量不大于0.3%。
4、 統計分析軟件
本文所用統計軟件包括JMP和理化方法驗證統計軟件（PCMV）。
5、 方法驗證及結果
5.1 系統適用性試驗
取“2.4”項下的混合對照品溶液，按照“3.1”的色譜條件進樣，獲得的色譜圖見圖1，出峰順序為馬來酸、依那普利拉和依那普利。依那普利峰的拖尾因子為1.0<2.0，馬來酸與依那普利拉分離度19.0>1.5，依那普利拉與依那普利分離度為30.9>4.0，依那普利拉理論塔板數不低于5000。
5.2 專屬性
取“2.4”項下的混合對照品溶液，按照“3.1”的色譜條件，進樣，獲得的色譜圖如圖1所示，馬來酸與依那普利拉分離度19.0>1.5，依那普利拉與依那普利分離度為30.9>4.0，方法的專屬性良好。
5.3 線性、檢測下限與定量下限和范圍
5.3.1 實驗設計
在濃度范圍為其質量限度標準（0.3%）的8.0%（預實驗確定的LOD）~200.0%內設置9個濃度點，0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0μg·mL-1，每個濃度獨立制備3份。
5.3.2 操作步驟
精密量取“2.3”項下10μg·mL-1的對照品溶液0.5、1和2mL，20μg·mL-1的對照品溶液2、4、5mL，30μg·mL-1的對照品溶液1、2和4mL，分別置10mL量瓶中，加溶劑2稀釋至刻度，制成約0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0μg·mL-1的對照品溶液，每個濃度獨立制備3份，進樣測定，試驗結果見表2。
5.3.3 線性數據分析
線性方程：以濃度X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，得濃度-峰面積的最小二乘回歸圖，見圖2。線性方程：Y=139.86+38982.17X r=0.9998截距估計值：截距為-139.86，截距的標準誤為867.04，t比為-0.16，概率>|t|值為0.87>0.5，統計上顯示截距與0沒有顯著性差異，由此確定依那普利拉雜質可通過外標法確定其含量。回歸線的標準誤為2695.87。
5.3.4 檢測下限與定量下限
基于“5.3.3”項的回歸方程，采用線性 95% 的預測區間確定分析方法的檢測下限與定量下限分為：
5.3.5 線性范圍
該分析方法在0.5~12.0μg·mL-1的濃度范圍內均滿足線性要求。
5.4 準確度和精密度
5.4.1 實驗設計
（1）對影響此方法的因素進行風險分析，確定本方法的主要影響因素：儀器、分析人員以及每個分析人員的獨立操作次數（時間）；
（2）通過預實驗，確定偏倚約為10%，變異約為5%，將α設為5%，效能設為90%時，通過JMP軟件求得所需的樣本量，即實驗次數不少于5次；
（3）以上述2個條件為基礎，將3個主要因素均設置2個水平，采用3因素全析因
設計，確定8個實驗條件（見表4），滿足參數計算的樣本量需求；
（4）濃度范圍選擇：以加標濃度為其質量限度標準（0.3%）的8.0%（預實驗確定的LOD）~150.0%為參考，設置7個濃度點：0.5、1、2、4、6、8、9μg·mL-1。
5.4.2 操作步驟
精密量取“2.3”項下10μg·mL-1的對照品溶液0.5、1、2mL，20μg·mL-1的對照品溶液2、4mL，30μg·mL-1的對照品溶液2、3mL，分別置10mL量瓶中，分別加“2.2”項下的供試品儲備液1mL，加溶劑2稀釋至刻度，制成加樣濃度約為0.5、1、2、4、6、8、9μg·mL-1的溶液，每個濃度獨立制備3份。按照“3.1”項下的色譜條件進樣。結果匯總于表4。
5.4.3 結果分析
5.4.3.1 精密度
通過對每個濃度進行方差成分分析，可獲得該分析方法在不同濃度下的重復性，中間精密度及其精密度上限值。設α=0.05，精密度結果表見表5。
5.4.3.2 準確度
通過對每個濃度下真實值（100%）與回收率結果的差值獲得方法在該濃度下的偏倚值，以及獲得其置信區間。設α=0.05時的結果分析表見表6。
5.4.3.3 方法能力的綜合評價
對于準確度與精密度的聯合判定，引入新的統計評價參數，方法變異、方法能力指數（MCI）、方法誤判率、方法分級、預測區間和容忍區間。假定雜質的質量標準在90.0%~110.0%時能滿足產品檢測的需求，則分析結果見表7。
圖3和圖4為在不同濃度下的預測區間或容忍區間與質量標準的關系圖。從表7、圖3和圖4可以看出，此分析方法在2.0~9.0μg·mL-1時，方法的準確度與精密度能滿足產品檢測需求。
5.5 方法適用范圍
在準確度、精密度、LOQ和線性滿足前提下的方法適用濃度范圍為2.0~9.0μg·mL-1。
5.6 溶液的穩定性試驗
一次進樣需運行45min，為保證在方法驗證期間，所配制溶液的穩定性，考察了供試品溶液在60h內的穩定性。
精密量取“2.1”供試品儲備液1mL至10mL量瓶中，加溶劑2稀釋至刻度，在0、5、10、20、30、40、50、60h按照“3”項色譜條件進樣，獲得依那普利和依那普利拉的峰面積。從表中可以看出，隨著所配制溶液放置時間的延長，依那普利拉逐漸增多，依那普利減少。在40h內，依那普利拉峰面積的RSD=0.72%，溶液維持穩定。
6、 討論和結論
6.1 馬來酸依那普利原料藥中依那普利拉雜質定量測定的檢測方法
2015年版《中國藥典》中對馬來酸依那普利原料藥中依那普利拉雜質進行的是限度檢查，該方法的系統適用性試驗在主成分和雜質組分均為20.0μg·mL-1時滿足藥典要求。但在進行實際產品檢測時，由于試驗時按2.0mg·mL-1濃度進樣（高于系統適用性濃度100倍），導致馬來酸峰與依那普利拉峰出現一定程度重合（圖5），使含量計算存在被低估的風險。
為使馬來酸峰與依那普利拉峰能完全分開，保證能夠準確定量依那普利拉峰，作者以歐洲藥典中原料藥依那普利拉的雜質進行限度測定方法的色譜條件為基礎進行優化，綜合考慮峰形、馬來酸峰與依那普利峰的分離度以及分析時間等因素，最終確定的色譜條件。
該方法的缺點是無法檢測到馬來酸依那普利中的雜質依那普利雙酮，但本實驗主要用于對雜質類定量分析方法性能參數的評估探討，故不影響此目的的闡述。
6.2 LOD和LOQ的確定
目前ICHQ2（R1）指南和專著給出的確定LOD與LOQ的方法可以歸為4類：
1）可視化的評估；
2）基于空白分布；
3）基于線性；
4）基于分析方法的精密度。
國內最常應用的是基于空白分布中信噪比法來確定LOD與LOQ。本文所計算LOD的方法是基于USP<1210>提出的線性95%的預測區間來確定，此方法不僅考慮了Ⅰ類錯誤與Ⅱ類錯誤，同時將實驗測定的變異性（不確定度）考慮在內。因此更加可靠和科學。
按照<1210>的闡述，該方法所得LOD可作為最小LOQ使用，但為保證LOQ更加可靠，本實驗將LOQ用10替代計算公式中的（t1-α；n-2+t1-α；n-2）。
6.3 準確度和精密度的獲取和描述
目前國內有關方法驗證的文章中通常對方法準確度的評價僅提供偏倚及其置信區間，無法從整體體現方法的變異。系統精密度和重復性的驗證，通過對某一對照品溶液連續進樣6針來確定儀器精密度，將同一供試品溶液平行制備6份來確定方法的重復性。該方法節省時間成本，但是不能夠正確表明方法在不同濃度下的變異性。
本文中有8個實驗條件，每個實驗條件下對每個濃度獨立制備3份溶液，通過方差成分分析可以同時確定中間精密度與重復性。同理對于重復性和儀器精密度也可以按照本文的方法確定。本文的試驗設計充分考慮了不同濃度下該方法的變異，從整體把握方法的適用性及其適用范圍。
為了更充分表達所獲準確度和精密度，本文所采用的設計，還能有效地計算出準確度置信區間和精密度置信上限，從而為技術人員和監管者更好地把握所得參數的可靠性提供依據。
6.4 方法能力綜合評價參數及其比單獨使用準確度
和精密度評價的優勢目前ICH指南、《中國藥典》和歐洲官方實驗室都使用準確度和精密度單獨的標準進行方法驗證的判定。這里的限度標準多通過經驗確定出，主觀性較大，且沒有與所檢測產品的質量標準直接聯系。
本次新增方法變異、預測區間和容忍區間、方法能力指數等綜合評價方法滿足其預期用途的參數（有關其詳細含義請參見參見USP<1210>和本專欄《定量理化分析類方法滿足預期用途的判斷標準探討》），是對準確度和精密度進行合成后衍生出的新參數，這些參數是對方法整體評價更全面的把握。
此外，將各濃度下計算的容忍區間和預測區間按濃度-質量標準限度進行構圖（見表7和圖3和圖4），可更清晰和直觀地了解方法在不同濃度下的判斷，具有科學、直觀的優勢。
本方法對依那普利拉雜質的檢測，在LOQ0.8~2.0μg·mL-1的范圍，只可確保標示量的±20%的變異內檢測準確，在2.0~9.0μg·mL-1濃度范圍，其容忍區間均包含于±10%以內，且對產品質量限度標準為6.0μg·mL-1濃度周圍，該方法的變異容忍區小于±5%，方法能力指數達到1.02，因方法變異產生的誤判率為0.2%；故認為是一個非常可靠的定量檢測方法。
本次方法驗證所獲預測區間和容忍區間不僅可用于新方法進行方法驗證，也為后續方法的轉移和驗證判定提供依據，即方法轉移或確認時，進行一次實驗所獲得的結果應分布于預測區間內，所有試驗結果的90%應處于容忍區間內。
6.5 結論
該方法滿足對馬來酸依那普利原料藥中依那普利拉雜質進行定量檢測的要求。在專屬性方面，依那普利拉峰與馬來酸峰和依那普利峰間的分離度分別為19.0和30.9。在線性、LOD和范圍方面：在0.5~1.2μg·mL-1的濃度范圍內呈線性相關，線性方程為Y=139.86+38982.17X，r=0.9998；殘差標準誤為2693.44，且殘差呈隨機分布，截距與零無顯著差異。
由此確定雜質依那普利拉可通過外標法確定其含量；基于線性95%的預測區間確定的LOQ為0.76μg·mL-1。在綜合能力評價方面：2.0~9.0μg·mL-1的濃度范圍內，方法的預測區間與容忍區間均分布于限度標準的90.0%~110%內，在產品質量標準限度6.0μg·mL-1周圍，方法可達到Ⅲ級方法，因方法產生的誤判率僅為0.2%。溶液穩定性：在40h內溶液維持穩定。
文章來源：《藥物分析雜志》2019年第39卷第2期
原標題：《雜質類定量分析方法驗證中的統計學評價》
作者：朱容蝶 ，耿穎 ，譚德講，楊化新，何蘭，劉萬卉（中國食品藥品檢定研究院）
