工藝表征和工藝驗證是藥物開發臨床實驗后期需要進行的重要工作，所處節點如圖1。
圖1：工藝表征和工藝驗證在藥物研發流程中所處環節
FDA工藝指南將工藝驗證 (Process Validation, PV) 定義為：“從工藝設計階段到商業化生產階段的數據收集和評估，建立科學證據表明工藝能夠始終如一地提供優質產品。”FDA將工藝驗證定義為一個連續的生命周期的過程。
工藝表征 (Process Characterization, PC) 的目標是確保有效和成功的工藝驗證和保證一致的工藝性能。工藝表征工作一般在臨床Ⅱ期結束后，工藝性能確認 (Process Performance Qualification, PPQ) 開始前進行。
工藝表征的目的是系統性地研究工藝參數和原材料屬性對工藝表現的影響，同時獲得工藝參數和工藝性能/質量屬性的可接受范圍，從而制定工藝控制策略。工藝表征實驗數據是在藥品上市前，除臨床實驗數據外，可向監管部門提供的具備長期穩定生產質量的證據。不充分的工藝表征可能會導致昂貴的批生產失敗和事故，失敗的驗證運行和困難的檢查。
該如何正確地準備和完成工藝表征研究呢?
基于法規解讀、行業實踐及生物工藝的可操作性，一個完整和成功的工藝表征研究主要包括工藝表征前的準備工作Pre-PC和工藝表征研究PC兩個階段，共7個主要步驟組成，詳見圖2。
圖2：工藝表征過程的關鍵步驟
1、信息收集
生產工藝是在工藝開發過程中定義的，在工藝開發前需要使用工藝流程圖或魚骨圖等，對生產工藝包括單元操作、工藝輸入和工藝輸出進行詳細描述。通常需要收集的數據包括：
收集臨床生產批次數據，確定生產工藝；
收集工藝開發和優化數據；
收集產品關鍵質量屬性CQA相關信息。
2、風險評估
FDA的工藝驗證指南指出，因為不可能對所有參數進行實驗性研究，因此需要使用一定的工具來篩選出高風險的工藝參數，即對工藝性能和產品質量屬性影響風險比較高的工藝參數。常使用的風險評估工具有：因果效應矩陣 (C&E) 、失敗模式與效應分析 (FMEA) 以及風險排序與過濾 (RRF) 等。
2.1風險評估所處階段
工藝表征研究需要進行兩次風險評估，即風險評估-2和風險評估-3，如圖3 A-Mab中總結了生物制藥工藝生命周期內的質量風險管理的應用。風險評估-2主要用于工藝表征之前，利用工具篩選出那些高風險性的工藝參數，這個過程需要考慮工藝平臺知識、文獻知識以及工藝開發過程中積累的知識。該階段的目的是指導工藝表征工作，包括確定工藝步驟的優先級，以及篩選需要進行工藝表征的工藝參數。風險評估-3是在工藝表征之后，即已經完成了工藝表征工作，該風險評估用來定義設計空間和形成控制策略草案。因此，尋找工藝中的潛在失敗模式并且制定緩解措施是該過程的主要工作。
圖3：生物制藥工藝生命周期內的風險評估
2.2風險評估工具
工藝表征后的風險評估目的是尋找工藝失敗模式和制定緩解策略，失敗模式和效應分析 (FMEA) 則是常用到的工具。FMEA是通過對識別的失敗模式進行其嚴重度S、發生頻率O和可探測度D三個維度的評估。根據評分數表對每一種失敗模式進行打分，最終失敗模式的風險程度是三個維度的乘積，即風險順序數 (RPN) =嚴重度S×發生頻率O×可探測度D。
風險分析通常先要對改進措施進行定義，明確現有的預防措施和探測措施后，可以對照FMEA評估表對S、O、D的值進行獨立評估，根據不同的S、O、D組合，查表確定風險控制的優先級 (AP) ，進而用于評估產品的可能 CQA，以及可能影響產品質量的CPP。
2.3CQAs評估和pCPP、CMA評估
關鍵質量屬性 (Critical Quality Attributes, CQA) ，ICH Q8 (R2) 法規指南中定義CQA指在適宜限度、范圍和分布內以保證藥品質量的物理、化學、生物或微生物屬性或特性。通過風險評估，結合對產品的理解，以及相關歷史數據，評估出產品CQA，這是表征活動的出發點。CQA主要由產品的QTPP概況引申而來，分別由其安全性和有效性決定。CQA的評估主要基于產品對患者的影響，而不是工藝的能力或歷史數據，如圖4基于QbD風險評估蛋白藥物的質量屬性。
圖4：基于QbD風險評估蛋白藥物的質量屬性
關鍵工藝參數 (Critical Process Parameter, CPP) 根據ICH Q8指對關鍵質量屬性 (CQA) 有影響的工藝變量，應予以監控或控制以確保藥品獲得所需的質量。根據評估得到的CQA，進一步采用風險評估的方法（如FMEA、因果矩陣、流程圖、魚骨圖）從大量的工藝參數中剔除出非關鍵的工藝參數，篩選出潛在的CPP (pCPP) ，如圖5A-mab中生產生物反應器中工藝參數的第一輪風險評估結果。通過后續實驗中研究，進而獲得穩健的控制策略。
圖5：A-mab中生產生物反應器中工藝參數的第一輪風險評估結果。CPP=影響質量屬性的參數 - 必需嚴格控制，穩定性有限；WC-CPP=影響質量屬性的參數 - 良好控制，運行穩定；KPP=影響工藝屬性的參數；Non-KPP=不影響QA或PA的參數
3、建立和確認縮小模型
在生產規模上對工藝參數進行研究型工作是不現實的，因此需要設計實驗室規模的模型來代表生產規模是非常必要的，即縮小模型。
3.1細胞培養縮小模型的建立原則
在細胞培養縮小模型的建立過程中與細胞放大原則一致，一般來說非體積依賴性參數保持一致（如pH值、溫度、補料策略等）；對于體積依賴參數，通常采用等P/V或等葉尖速度，從而保證攪拌效果一致；或者保持O2、CO2的Kla與商業化生產保持一致，以保證氧氣傳質和CO2移除效率一致。
3.2縮小模型的多變量分析和等效性確認
法規指南對縮小模型的唯一要求是，縮小模型需要能夠代表商業化生產工藝。即需要對縮小模型進行確認，縮小模型的確認可以在大規模生產使用的操作范圍的中心點上來運行，需要確認縮小模型與大規模生產運行的性能一致，并且需要一個縮小模型確認的可接受標準。縮小模型的驗證，通常采用統計學相關的驗證方法，比如T檢驗、雙單側檢驗TOST、主成分分析PCA和多變量分析PLS等。
對建立的縮小模型，需要與生產批數據進行過程代謝，產品質量等方面進行可比性研究，確認縮小模型可代替商業化生產規模。上游案例是通過9批商業化生產規模數據（圖6虛線），經SIMCA軟件（PLS分析模型）處理，建立±3SD或者95%置信區間，細胞培養過程代謝參數，產品質量數據和過程數據均處于該區間內，則證明縮小模型可比（圖7）。即該縮小模型可代替商業化規模，用于PC研究。
圖6：上-不同天數細胞代謝曲線得分圖 (SIMCA) ；下-預測六批次的縮小模型數據 (SIMAC)
4、工藝表征研究
工藝表征研究，從根本上是要解決兩個問題：
工藝參數的分類，即哪些是關鍵工藝參數 (CPPs) ，哪些是非關鍵工藝參數 (Non-CPPs) ；
關鍵工藝參數的設計空間范圍，也就是關鍵工藝參數必須要控制在什么范圍內，才能保證關鍵質量屬性的可接受范圍；
除此之外，工藝表征研究還需要考慮到雜質清除的研究（包括挑戰性實驗），關鍵原材料的研究以及單元操作之間的鏈接研究。
對不同的實驗階段，如細胞復蘇、傳代、擴增、N-1和生產階段，通常在縮小模型上設計實驗以研究高風險的工藝參數對工藝性能和產品質量的影響，常用的實驗類型包括單因素 (OFAT) 、實驗設計 (DoE) 、最差條件研究 (Worst case) 或N-1連接 (Linkage) 等的研究。
4.1單因素實驗OFAT
單因素實驗，也稱為一次一個因子 (OFAT) 實驗（圖8），即每一次實驗只改變一個工藝參數的水平，而其他的工藝參數保持某一水平不變。單因素實驗是比較簡單的實驗方法，可以采用方差分析或回歸分析來分析實驗結果，得出工藝參數的關鍵性和可接受范圍。單因素實驗的缺點是無法研究工藝參數之間的交互效應，而這在生物制藥工藝中常常是存在的。
4.2實驗設計DoE
實驗設計 (DoE) 是一種結構化、有組織的方法，是監管機構鼓勵采用的方法，用于確定特定工藝過程中影響因素和輸入結果之間的關系（圖8）。在工藝表征過程中，需要進行科學合理的DoE實驗設計對CPP進一步表征，從而確定出CPP的操作范圍。這部分工作的主要目的是為了給商業化生產制定工藝操作范圍的邊界，最終確定控制策略。在工藝表征中，原材料可變性如培養基的研究，也可以將原材料的批次作為一個因子納入實驗設計 (DoE) 中從而在工藝表征的實驗性研究中。
圖8：單因素實驗 (OFAT) 和實驗設計 (DoE)
5、統計學分析和最差條件研究
5.1CPP和KPP的確認
實驗結束后，需對數據進行分析，通過采用蒙特卡洛Monte Carlo模擬，并結合等高線刻畫的方式確定參數的設定范圍及最佳操作點（如圖10）。同時可采用蒙特卡洛模擬對最差條件進行預測，即分別對某關鍵質量屬性CQAs中達到最差情況時，對重要工藝參數KPP和關鍵工藝參數CPP進行預測，然后在縮小模型上進行Worst case的實驗驗證。
在統計學數據分析中，當某工藝參數的變化對CQA影響的p值<0.05時，就認為這一參數具有統計顯著性（如圖9），這些工藝參數被人們定義為關鍵工藝參數CPP，但是可能會導致一些對于CQA有影響但變異性不大的參數被識別為CPP，不合理地增加了CPP的數量，加大了后續工藝控制的難度。很多國際大廠如Roche/Genentech等可采用實際顯著差異的理念對CPP進行識別，通過實際顯著性的理念結合DoE數據分析及CQA實際情況兩個維度對關鍵工藝參數進行評估，從而更加合理地進行CPP的識別工作。
圖9：CPP評估流程。注：P<0.05 只能說是統計學顯著性，同時可采用Roche/Genentech等實際顯著差異的理念對CPP進行識別，這里不過多介紹。
5.2定義設計空間
根據DoE實驗結果或單因素/失敗邊緣考察，確定設計空間。針對設計空間的邊界可確定單因素的參數經驗證的可接受范圍 (PAR) ，當保持其他參數恒定時，此參數范圍內操作將生成符合相關質量標準的物料。
在參數設定中點上，結合設備和工藝的波動范圍，在PAR范圍內可確定正常操作范圍 (NOR) 。在商業化生產中工藝參數一旦超過PAR/NOR就表示該批次失敗，而任何在設計空間范圍內的變化都不視為變更，無需向監管部門提交補充申請并獲得批準（圖10）。
圖10：蒙特卡洛模擬結合等高線圖確認設計空間
6、第二輪風險評估更新
在完成表征工作后，返回重復風險評估FMEA評估可能是有價值的。此時，每個操作參數的嚴重程度因子已知，在某些情況下，這可能會極大地改變風險優先級數字的結果。如圖11生產生物反應器中工藝參數的最終風險評估結果和對比圖5的第一輪風險評估結果相對比，我們不難發現一些之前被認為是影響關鍵質量屬性CQA的CPP參數可能是良好控制，運行穩定的WC-CPP，一些第一輪我們認為會影響工藝性能KPA的重要工藝參數KPP，可能是Non-KPP。通過兩輪的風險評估，工廠工程師可以將他們的時間更好地投入到那些需要最大控制和檢測的操作單元和操作參數上。
圖11：A-mab中生產生物反應器中工藝參數的最終風險評估結果。WC-CPP=影響質量屬性的參數-良好控制，運行穩定；KPP=影響工藝屬性的參數；Non-KPP=不影響QA或PA的參數
7、建立控制策略
通過工藝表征研究需要確定關鍵質量屬性和關鍵工藝參數的列表，以及關鍵質量屬性的可接受范圍與關鍵工藝參數的設計空間，以確保對藥物的安全性和有效性。
關鍵質量屬性CQA上通常需要各種分析檢測來控制，比如工藝中控、放行檢測、穩定性檢測、表征和可比性檢測等；
關鍵工藝參數CPP的控制則是通過工藝程序和操作規程控制，保證其在設計空間內；
關鍵物料參數CMA如培養基是通過良好的可擴展性、準確的可預測性以及較小批次之間差異。
Genentech公司曾介紹了一個基于風險評估的屬性檢測策略 (ATS) 的控制策略，如圖12所示。
圖12：Genentech屬性檢測策略 (ATS) 的控制策略流程圖案例
總 結
工藝表征的目的是系統性地研究工藝參數和原材料屬性對工藝表現的影響，通過第一階段工藝表征前Pre-PC的信息收集、風險評估、縮小模型建立，第二階段工藝表征PC階段的實驗設計、統計學預測、最差條件研究、結合第二輪風險評估篩選出關鍵工藝參數CPPs、關鍵物料屬性CMAs和KPPs并確定其可接受范圍PAR和可操作空間NOR，最終建立工藝控制策略，為后續工藝驗證PV、采用PAT過程監控控制策略CS、產品整個生命周期管理打下基礎。
