一、 背景
1）利用(Q)SAR軟件進行化合物的致突變性評估，無需進行復雜的毒性試驗，已越來越廣泛地應用于藥物的基因毒性雜質評估中。商業(yè)化的軟件目前市面上有好幾家，如最常用的CASE Ultra，Derek&Sarah，Leadscope等。但上述軟件的授權費用較貴，且委外評估費用也較高，基于目前雜質需要全評估的趨勢，對企業(yè)來說是一筆不小的開支。其實也有一些免費的QSAR軟件，其不僅預測準確率較高，且也被歐美法規(guī)機構所認可，不失為基因毒性雜質初步評估的一個選擇。
2）根據(jù)ICH-M7章節(jié)6中的描述：“危害性評估首先通過對數(shù)據(jù)庫和文獻的檢索獲得的雜質致癌性和細菌致突變數(shù)據(jù)對實際和潛在雜質進行初步分析，根據(jù)表 1 將其歸為 1 類， 2 類或 5 類。如果無法獲得這樣的分類數(shù)據(jù)，則應進行預測細菌致突變性的構-效關系（ SAR）評估。根據(jù)評估結果將雜質歸為 3 類、 4 類或 5 類。”
指南該段話對企業(yè)而言，即應這樣進行危害性評估：先文獻和數(shù)據(jù)庫檢索雜質的相關致癌性和Ames數(shù)據(jù)，然后根據(jù)結果分類為1,2,5類；如果無法找到相關數(shù)據(jù)，應進行QSAR評估，根據(jù)評估結果分類為3類，4類和5類。
在FDA2021年3月進行了DMF培訓中，Drug Master File and Drug Substance Workshop – FDA CDER SBIA Events
在day2: ICH M7(R1) – Chemistry and Manufacturing Control (CMC) Perspective on Hazard Assessment – Barbara O. Scott 中明確指出：通過目視判斷化合物警示結構分類是不符合ICH-M7規(guī)定的。
3）在近期的各國監(jiān)管評審過程中，已收到多次缺陷，需要對所有使用的物料和雜質進行致突變性評估，即使它沒有警示結果或者推測肯定是無致突性的。
Deficiency-1：QSAR or genotoxicity information for all matters
Recent trend of document examination by PMDA, QSAR for all matters is required even if they do not have alert structure.
Deficiency-2：Provide the genotoxicity data (experimental data or (Q)SAR report) of all the reagents, starting materials, intermediates and related substances involved in the manufacturing of API（MFDS）
二、 評估方法
1）采用毒性數(shù)據(jù)庫，對常見的商業(yè)化物料進行毒性數(shù)據(jù)檢索，重點進行基因毒性檢索及致癌性數(shù)據(jù)檢索。上述檢索可通過常用的一些免費數(shù)據(jù)庫來進行，也可通過免費的QSAR TOOLBOX 軟件來進行。
最常用的3個網(wǎng)站如下：
Lhasa Carcinogenicity Database：可查詢物質的致癌性數(shù)據(jù)及TD50值，查詢后需對結果進行判斷，判斷數(shù)據(jù)是否充分且符合ICH S1的要求。
NTP database：可查詢物質的致癌性數(shù)據(jù)及體外體內基因毒性數(shù)據(jù)，Ames實驗需判斷是否滿足OECD的指南要求，同時關注有無代謝活化情況下的結果差異。
ECHA database: 可在該物質的toxicological information中查看Genetic toxicity 和Carcinogenicity
QSAR Toolbox的數(shù)據(jù)查詢功能
a.選用簡易用戶模式，進入結果，點擊Define輸入目標化合物
b.點擊Specific data, 勾選Human health hazards，然后點擊Collect data
c.在data results 界面可查詢對應類別的實驗性毒性數(shù)據(jù)，重點關注遺傳毒性和致癌性，可點擊相應的數(shù)據(jù)查看數(shù)據(jù)的source 和reference。
2）采用FDA認可的免費QSAR評估軟件進行評估。FDA認可的QSAR軟件如下：
統(tǒng)計學規(guī)則：CAESAR/VEGA
https://www.vegahub.eu/portfolio-item/vega-qsar/
專家規(guī)則：Toxtree, OECD Toolbox，
Toxtree: https://toxtree.sourceforge.net/
OECD Toolbox: https://qsartoolbox.org/download/
對于免費QSAR軟件評估接受性的擔憂，可參考FDA 2021年3月進行了DMF培訓中說明：
CDER已經(jīng)對這些免費的QSAR有了前期的知識儲備，因此可以不用再遞交經(jīng)過驗證的QMRF，可直接進行結果說明即可。
Drug Master File and Drug Substance Workshop – FDA CDER SBIA Events
Application of (Q)SAR and Expert Knowledge for ICH M7 Impurity Classification– Naomi L. Kruhlak
三、 免費QSAR軟件具體使用方法：
根據(jù)ICH-M7章節(jié)6中的描述：“計算機毒理學應采用（定量）構-效關系（（Q）SAR）方法學進行毒性評估，目的是預測細菌致突變試驗（參考文獻 6）的結果。應采用兩種互補的（Q）SAR 預測方法。一種方法應基于專家知識規(guī)則，另一種方法應基于統(tǒng)計學。（Q）SAR 模型采用的這些預測方法學應遵循經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）制訂的一般的驗證原則。如果經(jīng)兩種互補的（Q）SAR 方法（專家知識規(guī)則和統(tǒng)計學）預測均沒有警示結構，則足以得出該雜質沒有致突變性擔憂的結論，不建議做進一步的檢測（歸為表 1 中的 5 類）。”
因此我們需要采用不同原理的兩種QSAR軟件來對雜質進行評估，具體的策略如下：
-----采用Toxtree或QSAR Toolbox 進行專家規(guī)則的評估
-----采用VEGA進行統(tǒng)計學規(guī)則的評估
-----若兩個評估結果都為陰性，可直接判斷為5類雜質；
如其中一個為陽性，建議對該雜質采用商業(yè)化評估軟件（如CASE Ultra，derek&sarah，leadscope）進行評估，以商業(yè)化評估軟件出具的結果為準。
3.1 Toxtree的使用方法
軟件最新版本：Toxtree 3.1.0
決策樹選擇：點擊最上欄中的method，點擊select a decision tree，選擇：In vitro mutagenicity (Ames test) alerts by ISS，然后點下方確定按鍵。
化合物鍵入：在Chemdraw中將化合物的結構轉化為SMILES, 復制后輸入搜索框，核對左下角的結構是否與目標結構一致，然后點擊Estimate 運行。
觀察左邊窗口的結果及中間的色條顯示，若結論為：No alerts for S.typhimurium mutagenicity，則表示為陰性。
3.2 VEGA的使用方法
軟件最新版本：
化合物鍵入：在Chemdraw中將化合物的結構轉化為SMILES, 復制后輸入搜索框，點擊+號，核對右邊顯示的結構是否與目標雜質一致。
模型選擇：點擊左邊SELECT,然后選擇Mutagenicity（Ames test）model（CAESAR）-V.1.0.3
報告路徑選擇：點擊Export，選擇PDF reports（one for each model）,然后選擇在計算機中報告輸出的路徑。
預測：點擊PREDICT進行預測，在設定的路徑下找到生成的預測報告，根據(jù)報告中小球的顏色及下方的評論，判斷預測的結果。綠色表示陰性，紅色代表陽性。
3.3 QSAR Toolbox的使用方法
由于QSAR Toolbox與Toxtree為同一規(guī)則，且使用的決策樹均為In vitro mutagenicity (Ames test) alerts by ISS，兩者預測結果是一樣的。考慮到Toxtree為java形式運行，使用更方便，建議直接用Toxtree即可。
雜質評估結果在CTD資料中的書寫格式：
參照如下格式在CTD資料中提交雜質的hazard assessment summay，在comments 中加入experimental data source ，具體使用的QSAR軟件和相關的控制策略簡述。
參考文獻：
[1] ICH. Assessment and control of DNA reactive (mutagenic) impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risk M7(R2). International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH)
[2] Honma M, Kitazawa A, Cayley A, et al. Improvement of quantitative structure–activity relationship (QSAR) tools for predicting Ames mutagenicity: Outcomes of the Ames/QSAR International Challenge Project. Mutagenesis. 2019; 34(1): 3– 16.
[3] Cassano, A., Raitano, G., Mombelli, E., Fernández, A., Cester, J., Roncaglioni, A., Benfenati, E., 2014. Evaluation of QSAR models for the prediction of Ames genotoxicity: a retrospective exercise on the chemical substances registered under the EU REACH regulation. J. Environ. Sci. Health C 32, 273–298.
