采用培養(yǎng)基代替藥品進行無菌工藝模擬試驗，是無菌生產(chǎn)工藝的一種必要方式。為了確保無菌產(chǎn)品的無菌性，文章對凍干產(chǎn)品無菌工藝模擬試驗方案的實施進行闡述，介紹了該方案的準備條件，灌裝、凍干和軋蓋過程，過程取樣以及環(huán)境監(jiān)控等，對方案進行部分改進，優(yōu)化了方案內(nèi)容，并對無菌工藝模擬試驗的結(jié)果進行分析，結(jié)合實例探討了西林瓶生產(chǎn)線凍干產(chǎn)品培養(yǎng)基試驗的策略，以提高非最終滅菌產(chǎn)品的無菌保障水平。
1、引言
無菌工藝模擬試驗是指采用微生物培養(yǎng)基替代無菌產(chǎn)品，對整個無菌生產(chǎn)工藝進行評估驗證的技術(shù)，通常也被稱為“培養(yǎng)基灌裝試驗”。需要把培養(yǎng)基灌裝于無菌容器中，并在無菌生產(chǎn)環(huán)境中進行轉(zhuǎn)運，通過模擬此無菌工藝的過程，最后將灌封有培養(yǎng)基的容器在適當溫度下進行培養(yǎng)，檢查容器內(nèi)微生物的生長狀況，來對無菌工藝模擬試驗的結(jié)果進行評價，評價該試驗是否在操作過程中產(chǎn)生了污染。通常將此試驗應用于非最終滅菌的無菌產(chǎn)品中，而對最終滅菌產(chǎn)品沒有強制的要求。
根據(jù)《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010 年修訂）》（Good Manufacturing Practice of Medical Products，GMP）以及附錄1的“無菌要求”，無菌產(chǎn)品的生產(chǎn)應當進行培養(yǎng)基灌裝試驗。在無菌生產(chǎn)過程當中，對于直接接觸藥物的設(shè)備、部件、灌裝容器以及原料，雖然已經(jīng)過滅菌，但是當采用這些要素進行無菌生產(chǎn)時，仍然會由于各種因素導致產(chǎn)品發(fā)生污染，從而影響了無菌產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，無菌工藝的評估應當采用一種更合適的方式進行。無菌工藝模擬試驗，是對無菌工藝進行評估的一種驗證技術(shù)，采用培養(yǎng)基模擬完成實際無菌生產(chǎn)操作后，可以對結(jié)果進行評價，借以確定實際生產(chǎn)中產(chǎn)品被污染的概率。
2、無菌工藝模擬試驗方案技術(shù)要求
廣西梧州制藥（集團）股份有限公司生產(chǎn)的無菌產(chǎn)品為凍干制劑，故以凍干產(chǎn)品的無菌工藝模擬試驗來模擬整個工藝過程，包括從部件、材料的滅菌準備，一直到完成灌裝和軋蓋等整個過程。
而對于無菌工藝模擬試驗方案的設(shè)計中，工藝條件的選擇應當選取合理的“最差條件”，即整個工藝流程，應采用最差條件來進行試驗。最差條件即在工藝規(guī)程允許范圍內(nèi)，正常生產(chǎn)會遇到的最差情況，其并不包括由偏差引起的超出工藝要求的特殊情形。如果在最差條件下培養(yǎng)基灌裝試驗仍然取得好的結(jié)果，那么說明在比最差條件還要好的正常實際生產(chǎn)過程中，無菌保證水平會更有保證。
2.1無菌工藝模擬試驗最差條件設(shè)計
凍干產(chǎn)品的無菌工藝模擬試驗最差條件設(shè)計，可以包括在準備階段將物料、灌裝器具、設(shè)備等按照工藝要求在無菌條件下放置允許的最長時間；灌裝時可以在關(guān)鍵區(qū)域保留最多的人員；模擬在工藝允許范圍內(nèi)更長的灌裝時間；控制無菌工藝模擬試驗灌裝速度等。
2.2最差條件具體實施方式
2.2.1 控制物料、器具、設(shè)備等放置時間
凍干工藝所采用的西林瓶、膠塞、鋁蓋、灌裝器具、配料系統(tǒng)和凍干柜，將其滅菌并放置工藝規(guī)程允許的最長時間后使用，如表1所示。
表1 包材、器具與設(shè)備滅菌后放置時間記錄表
其中，為了考察其放置最長時間后的無菌水平，西林瓶、膠塞和鋁蓋在放置結(jié)束后，均取樣進行了無菌性檢查，結(jié)果均符合無菌工藝要求，可繼續(xù)用于無菌工藝模擬試驗。
2.2.2 控制灌裝人數(shù)
參與無菌工藝模擬試驗的關(guān)鍵區(qū)域人員，均按表2所示進行人員控制。進行無菌工藝模擬試驗時，實際操作人員數(shù)量均按工藝規(guī)程允許的最大人員數(shù)量進行。其中，各潔凈室組成人員，可由操作工、維修人員和檢測人員組成，操作人員負責無菌模擬試驗的生產(chǎn)操作，檢測人員負責微生物取樣、環(huán)境監(jiān)控等操作，維修人員負責對設(shè)備進行模擬維修或突發(fā)情況的處理。
表2 培養(yǎng)基灌裝試驗人員控制記錄表
2.2.3 灌裝速度與時間控制
在灌裝運行速度上，基于風險評估，應對灌裝速度進行評估并說明所定速度的理由。一般來說，對于廣口的容器，可采用在無菌生產(chǎn)區(qū)暴露較長時間的工藝，即降低灌裝速度，考察無菌過程是否受到污染；而對于瓶口較小的容器，可采用高速運行的方式來評估，在高速運行中進行大量手工操作干擾，用于評估無菌生產(chǎn)工藝是否受到污染。
培養(yǎng)基灌裝的持續(xù)時間控制是方案設(shè)計時必須考慮的重要問題，綜合考慮生產(chǎn)操作、操作干擾和實際無菌操作的周期后，盡管最準確的方法是模擬全批量的操作時間，因為其最能反映實際生產(chǎn)運行的情況，但也可以有其他合理且適當?shù)哪Ｊ剑A估模擬試驗的時間一般不少于正常實際操作生產(chǎn)的時間，以更好地反映整個過程所帶來污染的風險。
3、試驗先決條件檢查
3.1廠房設(shè)施設(shè)備以及公用系統(tǒng)的準備
廠房設(shè)施設(shè)備以及公用系統(tǒng)的準備具體內(nèi)容如下[1]。進行凍干產(chǎn)品無菌工藝模擬試驗，需要確認工藝設(shè)備、公用系統(tǒng)和輔助設(shè)施都已經(jīng)按照預期進行了相應的驗證，且物品、廠房和設(shè)施所使用的消毒劑和消毒方式也完成了相應的驗證。
對于藥液及產(chǎn)品所接觸到的氣體、設(shè)備組件、容器、器具滅菌工藝都應完成相應的驗證，無菌生產(chǎn)區(qū)域的環(huán)境，應達到設(shè)計要求，能夠持續(xù)穩(wěn)定地運行。
3.2人員的培訓
參與無菌工藝模擬試驗的人員，應接受藥品GMP、無菌操作、微生物知識以及實施無菌模擬試驗的相關(guān)培訓，且進入無菌潔凈區(qū)的全部人員，都應通過無菌更衣程序的確認，確認每位參與者可進入的區(qū)域以及其所允許的無菌操作項目。
3.3培養(yǎng)基及相關(guān)包材的準備
進行無菌工藝模擬試驗，應充分考慮模擬介質(zhì)與無菌工藝的適宜性，應結(jié)合被模擬產(chǎn)品的特點以及模擬介質(zhì)的可過濾性、澄清度、滅菌方式等方面來選擇培養(yǎng)基，盡可能地模擬無菌生產(chǎn)工藝流程，且不應該選擇具有抑菌性的模擬介質(zhì)，以確認模擬試驗的可信度。通常可以采用的培養(yǎng)基為胰酪胨大豆肉湯（Tryptic Soytone Broth，TSB），其無抑菌作用，且滅菌方式簡單易操作；易溶解和擴散（若溶解性不好，懸浮在培養(yǎng)基中的模擬介質(zhì)使培養(yǎng)基發(fā)生渾濁，容易影響結(jié)果的判斷）；易清潔，對設(shè)備沒有腐蝕性，對人體無害，不會對環(huán)境造成污染。培養(yǎng)基在使用前已進行除菌過濾，其滅菌方式應經(jīng)過驗證。
無菌工藝模擬試驗所用到的包裝材料，應按相關(guān)質(zhì)量標準檢驗合格，具備檢驗合格報告單。
4、無菌工藝模擬試驗方案的實施
4.1檢測儀器與設(shè)備
ApexZ50 激光塵埃粒子計數(shù)器、MAS-100NT浮游菌采樣儀。
4.2材料與試劑
TSB 培養(yǎng)基、TSA 培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿（55 mm、90 mm）、西林瓶（7 mL）、膠塞、鋁蓋。
4.3無菌工藝模擬試驗實施過程
凍干產(chǎn)品的無菌工藝模擬試驗模擬的是整個工藝過程，包括培養(yǎng)基準備過程、灌裝過程、凍干過程、軋蓋過程和培養(yǎng)基微生物的培養(yǎng)過程，應在與實際生產(chǎn)相同條件下盡量模擬實際生產(chǎn)完成的相應操作，還應充分考慮生產(chǎn)時可能造成污染的各種因素，對各種干擾活動進行模擬，模擬無菌灌裝期間遇到的最差狀況下的操作。
4.3.1 培養(yǎng)基準備過程
試驗所使用的培養(yǎng)基應是經(jīng)過微生物促生長能力檢測合格的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基（TSB）配制完成后，經(jīng)除菌過濾至無菌儲罐中，并在無菌儲罐中貯存工藝允許的最長時間，貯存結(jié)束后，進行下一步的模擬灌裝試驗。
4.3.2 灌裝過程
灌裝前，應按正常生產(chǎn)操作進行灌裝部件的組裝，并進行裝量的調(diào)節(jié)。由于培養(yǎng)基灌裝量較大（約9萬支），且為瓶口較小的7 mL 西林瓶，故采用高速灌裝，并在灌裝過程中穿插干擾操作的模式來進行模擬，根據(jù)洗烘灌聯(lián)動線的整體性能，把灌裝速度控制在350 支/min，灌裝第2 h 和第4 h，分別模擬一次灌裝干擾操作，綜合考慮生產(chǎn)操作、各種干擾和實際無菌操作的周期后，決定總灌裝時長約為6 h。
4.3.3 灌裝干擾操作實施與改進
在無菌工藝模擬試驗過程中，必須模擬所有正常操作的活動，包括取樣、稱重、沉降菌換皿、層流車轉(zhuǎn)運和產(chǎn)品出入凍干柜等，而除了這些計劃的活動以外，還存在非計劃卻不可避免發(fā)生的活動，比如西林瓶倒瓶、爆瓶的處理，灌裝異常的處理，各種灌裝機故障維修等，因此本次無菌工藝模擬試驗在進行所有正常操作的活動外，通過改進方案，需進行非正常的突發(fā)事件的處理來模擬最差生產(chǎn)狀況[2]。表3 可以作為本次無菌模擬試驗干擾項目和頻次的參考。
4.3.4 凍干過程
灌裝完的西林瓶運送至凍干柜內(nèi)，關(guān)閉凍干柜門后，放置10 h 后，模擬抽真空補氣操作2 次（每次抽真空至500～600 mbar），引發(fā)柜內(nèi)空氣流動，再通過無菌空氣達到氣流平衡。
4.3.5 軋蓋過程
凍干結(jié)束后，打開柜門擺放至少2 h，西林瓶出柜，放置密閉車至少6 h，然后進行軋蓋，軋蓋完成后，所有培養(yǎng)基產(chǎn)品全部制備完畢。
4.3.6 目檢過程
軋蓋后的產(chǎn)品轉(zhuǎn)移至目檢操作間，人工進行目檢檢查。
4.3.7 微生物的培養(yǎng)
已灌裝的培養(yǎng)基應當在適當?shù)臈l件下進行培養(yǎng)，以檢出微生物，且培養(yǎng)溫度應適宜于一般微生物及環(huán)境分離菌的恢復生長。
（1）陰性對照。在模擬灌裝過程中，抽取16支灌裝并半加塞的培養(yǎng)基，進行壓塞密封，作為陰性對照品，其中8 支于30 ℃～35 ℃條件下培養(yǎng)14 天，另8 支于20 ℃～25 ℃條件下培養(yǎng)14 天，其陰性對照不應出現(xiàn)渾濁。
（2）陽性對照。為了確認培養(yǎng)基的促菌生長能力，在模擬灌裝試驗中，抽取25 支灌裝后半加塞的培養(yǎng)基，壓塞密封，作為陽性對照品，其中5 支接種金黃色葡萄球菌混懸液，5 支接種銅綠假單胞菌混懸液，5 支接種枯草桿菌混懸液，5 支接種白色念珠菌混懸液，5 支接種黑曲霉懸浮液，各菌種混懸液均為0.1 mL，濃度＜100 cfu/0.1 mL。接種后，按藥典規(guī)定進行菌種的培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察陽性對照品的生長情況，應被證實有菌生長則為合格。
（3）試驗樣品的培養(yǎng)及調(diào)查。無菌工藝模擬試驗的全部樣品應當在適宜的溫度條件下培養(yǎng)14 天，先于較低溫度（20 ℃～25 ℃）下培養(yǎng)至少7 天，然后在較高溫度（30 ℃～35 ℃）下培養(yǎng)至少7 天，在低溫和高溫的培養(yǎng)過程中和培養(yǎng)結(jié)束后，分別觀察一次，并記錄檢查結(jié)果，若發(fā)現(xiàn)污染應明確記錄樣品數(shù)量，若出現(xiàn)破損應記錄并檢查破損原因。
由于灌裝數(shù)量超過10 000 支，若出現(xiàn)1 支污染，需進行調(diào)查；出現(xiàn)2 支污染，需調(diào)查后進行再驗證。培養(yǎng)基灌裝的標準允許少量污染瓶的存在，但這絕對不是允許投放市場的
無菌產(chǎn)品中可以存在受污染的狀況，無菌工藝的目的就是防止污染，發(fā)現(xiàn)任何污染樣品均應進行調(diào)查，分離到的污染微生物更應鑒別到種。若培養(yǎng)基灌裝反復出現(xiàn)污染，即使每次都符合標準，也必須采取更嚴格的防污染措施[3]。
4.3.8 過程取樣及環(huán)境監(jiān)控
無菌工藝模擬試驗過程中，需對過程中的無菌包材進行取樣，并對環(huán)境進行監(jiān)控，以考察生產(chǎn)操作的實際情況，不應采取特別的生產(chǎn)控制和預防措施，制造特別良好的工藝環(huán)境，這樣會導致不準確的評估結(jié)論，造成工藝條件良好的假想，過程取樣及環(huán)境監(jiān)控如表4 所示。
5、結(jié)束語
本文詳細描述了凍干產(chǎn)品無菌工藝模擬試驗的改進和實施。因不同的產(chǎn)品劑型，如懸浮液的無菌灌裝、無菌粉末產(chǎn)品、無菌霜劑、無菌乳膏劑等，工藝會有一些差異，灌裝過程中的干預方式、操作方式等在方案的設(shè)計上會有細節(jié)的不同，需要技術(shù)人員根據(jù)不同的劑型進行方案設(shè)計，并完整記錄整個過程，在培養(yǎng)結(jié)果發(fā)生異常時，灌裝過程的記錄會成為基礎(chǔ)的調(diào)查證據(jù)。隨著法律法規(guī)的不斷完善，制藥工藝的不斷優(yōu)化和制藥工業(yè)企業(yè)的不斷發(fā)展，無菌工藝模擬試驗方案的設(shè)計將會愈加完善。
參考文獻
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本文作者周凡婷、鄧凱，廣西梧州制藥（集團）股份有限公司，來源于大眾科技，僅供交流學習。
