多肽藥物一般被定義為由少于40個氨基酸殘基通過酰胺鍵組成的聚合物。由于多肽藥物具有很高的受體活性和選擇性，較低的毒副作用風(fēng)險，制藥行業(yè)對多肽產(chǎn)生了濃厚的興趣。期間也出現(xiàn)了很多明星藥物，他們大多集中在代謝疾病領(lǐng)域，如GLP-1類似物索馬魯肽，胃抑制多肽(GIP)和胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)雙受體激動劑替西帕肽等。此外，隨著PDC，RDC藥物的興起。目前用于制備多肽藥物的方法主要有化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法。生物發(fā)酵法主要用于長肽的制備，其優(yōu)勢在于生產(chǎn)成本低，但無法在肽序中引入非天然氨基酸，也無法對肽鏈進行各種修飾，因此它的應(yīng)用也受到了很大的限制。化學(xué)合成法包括固相合成法和液相合成法，其中固相合成法相比液相合成法有其顯著的優(yōu)點：可以使用過量的物料進行反應(yīng)以確保完全偶聯(lián)，通過簡單的對洗滌操作就可以除去過量的氨基酸，縮合劑，副產(chǎn)物等，避免了復(fù)雜的后處理與純化操作，提高生產(chǎn)效率等，因此固相合成法應(yīng)用最為廣泛。用于化學(xué)合成法合成多肽的原料包括起始物料，試劑，溶劑。他們的質(zhì)量特別是起始物料的質(zhì)量會對API的質(zhì)量產(chǎn)生不同的影響。起始物料主要指的是保護的氨基酸衍生物，用于肽鏈修飾的脂肪酸，聚乙二醇等作為重要的結(jié)構(gòu)片段并入原料藥的結(jié)構(gòu)中的物料，直接影響API的質(zhì)量，因此應(yīng)重點討論對起始物料的控制。
一、起始物料選擇的合理性
ICHQ11明確指出如果使用市售的化學(xué)品作為起始原料，申請人通常不需要對其合理化進行論證。市售化學(xué)品通常除了用作藥物的起 始原料外，還已經(jīng)在非藥用市場進行銷售。定制合成制備的 化學(xué)物質(zhì)不屬于市售化學(xué)品。雖然保護氨基酸沒有非藥用市場以滿足ICHQ11對市售化學(xué)品的定義，但是他們結(jié)構(gòu)簡單，具有明確的化學(xué)特性和結(jié)構(gòu)，易被分離和純化，且能使用常見的分析手段進行鑒別、檢測，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易于儲存、運輸，合成路線成熟，且目前國內(nèi)多家大型供應(yīng)商能夠持續(xù)生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定的保護氨基酸，為商業(yè)化容易獲得的物料，因此他們能夠被認(rèn)定為起始物料。但對于保護氨基酸以外的特殊結(jié)構(gòu)單元，可能需要額外的論證才能把它們定義為起始物料。
二、起始物料中有關(guān)物質(zhì)的控制
前面提到保護氨基酸作為重要的結(jié)構(gòu)片段并入到API的結(jié)構(gòu)中，直接影響API的質(zhì)量，因此我們要嚴(yán)格控制起始物料中雜質(zhì)的含量，了解這些雜質(zhì)在既定的工藝中發(fā)生的轉(zhuǎn)化與清除，最終明確他們與API中雜質(zhì)的關(guān)系。下面以Fmoc-Ala-OH為例，對保護氨基酸中的幾種雜質(zhì)進行說明：
1. 不正確的異構(gòu)體
在合成Fmoc-Ala-OH過程中，如果起始原料中含有D-Ala，按照工藝傳遞會生成相應(yīng)的Fmoc-D-Ala-OH 圖1。起始物料中一旦出現(xiàn)此類雜質(zhì)，就會隨著工藝一直傳遞到API中生成對應(yīng)的單氨基酸消旋肽雜質(zhì)，由于消旋肽雜質(zhì)和API的結(jié)構(gòu)極為相似，很難通過后續(xù)制備純化除去，因此應(yīng)嚴(yán)格控制對應(yīng)的保護氨基酸中的異構(gòu)體雜質(zhì)。此外，對于有多個手性中心的保護氨基酸，如Fmoc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH圖2，除了需要研究α-C的構(gòu)型之外，側(cè)鏈的手性中心也要考慮表1。例如Fmoc-Thr(tBu)-OH，除了研究常規(guī)的保護氨基酸中的雜質(zhì)之外，需要研究的異構(gòu)體雜質(zhì)有Fmoc-D-Allo-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc- Allo-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-D-Thr(tBu)-OH。值得注意的是Fmoc-Thr(tBu)-OH與Fmoc-D-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-D-Allo-Thr(tBu)-OH與Fmoc- Allo-Thr(tBu)-OH互為對映異構(gòu)體，使用普通的HPLC方法無法實現(xiàn)分離，可能需要用到手性柱。
圖1
圖2
表1
2. Fmoc保護的二肽
在合成Fmoc-Ala-OH過程中，過量的Fmoc-Osu會與生成的Fmoc-Ala-OH反應(yīng)得到Fmoc-Ala-OFm，再與剩余的Ala反應(yīng)得到Fmoc-Ala-Ala-OH圖1。此類雜質(zhì)也會隨著工藝一直傳遞到API中生成相應(yīng)的插入肽雜質(zhì)，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制。
3. Fmoc-β-丙氨酸衍生物
機理見圖3，在合成Fmoc-Osu過程中可能會生成β-Ala，β-Ala與過量的Fmoc-Osu反應(yīng)生成Fmoc-β-Ala-OH?；蛘?beta;-Ala與Ala、Fmoc-Osu依次反應(yīng)得到Fmoc-β-Ala-Ala-OH。此類雜質(zhì)也會隨著工藝一直傳遞到API中生成相應(yīng)的β-Ala替換肽和插入肽雜質(zhì)應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制。
圖3
4. 游離氨基酸或部分保護雜質(zhì)
由于沒有α-氨基或側(cè)鏈保護基團，游離氨基酸在活化過程中會生成復(fù)雜的多聚雜質(zhì)，應(yīng)嚴(yán)格控制。但游離氨基酸沒有保護基團，普通色譜柱不易保留且紫外吸收很弱，不適合使用HPLC控制?？梢愿鶕?jù)中國藥典2020年版四部通則0502使用薄層色譜法進行控制。
5. 非手性異構(gòu)體
主要指的是非手性的同分異構(gòu)體，如Ile和Leu；或氨基酸側(cè)鏈保護基團錯位保護產(chǎn)生的異構(gòu)體，如Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Fmoc-Glu-OtBu，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Asp-OtBu。
三、起始物料中的溶劑殘留
一般來說，考慮到多肽固相合成的特殊性，每步氨基酸偶聯(lián)完成及脫保護后都會使用大量溶劑洗滌肽樹脂，肽樹脂裂解得到的粗肽還會使用HPLC制備，凍干，因此殘留在保護氨基酸中的少量溶劑傳遞到最終API中的風(fēng)險很小。但這里應(yīng)特別注意乙酸，乙酸乙酯，醇類溶劑的殘留，因為這些溶劑可能在氨基酸活化偶聯(lián)過程與活化的氨基酸或肽鏈發(fā)生副反應(yīng)，如殘留的乙酸在氨基酸偶聯(lián)過程中會與肽鏈上裸露的氨基反應(yīng)導(dǎo)致肽鏈封端；殘留的醇類溶劑可能在氨基酸活化過程中與活化的羧基反應(yīng)造成活化的氨基酸被鈍化，使氨基酸當(dāng)量降低，最終可能導(dǎo)致氨基酸偶聯(lián)不完全，產(chǎn)生缺失肽雜質(zhì)。以鄭源生化某氨基酸為例圖4，該公司在COA中控制了乙酸乙酯，乙醇，甲醇，乙酸。其中乙酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)為≤0.5%，實際檢出為0.10%。根據(jù)ICHQ3C，乙酸乙酯為3類溶劑，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為≤0.5%符合的ICHQ3C要求，但是考慮到乙酸乙酯可能造成氨基乙?；舛说娘L(fēng)險，我們還應(yīng)對乙酸乙酯進行加標(biāo)研究，確定一個更加合適的標(biāo)準(zhǔn)。
圖4
四、起始物料中的元素雜質(zhì)
根據(jù)ICHQ3D、USP<232>、USP<233>的要求，應(yīng)對所有API的元素雜質(zhì)進行評估。從ICHQ3D中的附圖可知，藥品中的元素雜質(zhì)可能來自于API，而起始物料中的元素雜質(zhì)也有傳遞到API中的風(fēng)險。因此，應(yīng)對起始物料中的元素雜質(zhì)進行評估與控制，特別是對于那些在生產(chǎn)工藝中使用金屬催化劑的起始物料。例如Fmoc-Thr(tBu)-OH的合成過程中需要用到金屬鈀催化脫除Cbz保護基圖5，根據(jù)ICHQ3D的要求，金屬鈀屬于2B類元素雜質(zhì)，若在工藝中有意添加，無論何種給藥途徑都需要研究。
圖5
五、TSE/BSE風(fēng)險評估
TSE(Transmissible Spongiform Encephalopathy)是一種可引起人和動物腦部病變的疾病，包括克雅氏癥（Creutzfeldt-Jakob Disease (CJD)），變異克雅氏癥（variant Creutzfeldt-Jakob Disease (vCJD)），人體庫魯?。↘uru in humans），瘋牛病（Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) in cattle），羊癢?。⊿crapie in small ruminants (sheep and goats)），鹿慢性消耗病（Chronic Wasting Disease (CWD) in cervids），以及貂慢性傳染性腦?。═ransmissible Mink Encephalopathy (TME) in minks）等。許多國家的現(xiàn)行法規(guī)要求必須對所有獲得許可的藥品進行含有傳染性海綿狀腦病的潛在風(fēng)險評估，包括歐盟法規(guī)EMA/410/01 《降低人及獸藥中的TSE風(fēng)險指南》和EC No 999/2001 《制定預(yù)防、控制和消除某些TSE的規(guī)則》，F(xiàn)DA 21CFR 189.5《禁用的牛材料》，我國TSE污染風(fēng)險小，目前無相關(guān)法規(guī)。
用于合成保護氨基酸的游離氨基酸可能來自于動物組織毛發(fā)水解，存在TES風(fēng)險，因此必須確認(rèn)供應(yīng)商提供的保護氨基酸的來源，評估TES風(fēng)險。當(dāng)然，更簡便的方式就是直接購買非動物源的氨基酸，同時需要供應(yīng)商提供一份TSE/BSE聲明，聲明內(nèi)容應(yīng)包括“XXX有限公司在此證明，我們生產(chǎn)的XXX產(chǎn)品符合以下要求：無動物源性成分；沒有來自或接觸到受影響的、或接受隔離的傳播動物海綿狀腦病/牛海綿狀腦病的動物材料。我們的生產(chǎn)設(shè)備中沒有使用動物或動物制品或動物副產(chǎn)品或獸用疫苗或動物病原體。”
六、對供應(yīng)商的要求
雖然目前沒有法規(guī)要求起始物料需要在GMP條件下生產(chǎn)，但為了保證供應(yīng)商能夠提供質(zhì)量合格且穩(wěn)定的起始物料，建議供應(yīng)商至少在“類GMP”的條件下生產(chǎn)，可以通過供應(yīng)商進行審計來考察是否有良好的質(zhì)量體系，生產(chǎn)文件體系和適當(dāng)?shù)目刂苼肀ＷC生產(chǎn)工藝穩(wěn)定且可靠，是否有資質(zhì)和能力保證起始物料的質(zhì)量，長期穩(wěn)定的供貨。為了降低風(fēng)險，還應(yīng)與供應(yīng)商簽訂質(zhì)量協(xié)議，要求其供應(yīng)的起始物料的生產(chǎn)工藝如果發(fā)生變更，必須提前通知我方，并且在獲得我方批準(zhǔn)后才能實施變更。為了進一步降低斷貨的風(fēng)險，除了選定一家起始物料的主供應(yīng)商之外，還建議選定至少一家輔供應(yīng)商。供應(yīng)商應(yīng)提供相應(yīng)的資質(zhì)證明文件，包括營業(yè)執(zhí)照、生產(chǎn)許可證、工藝路線、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和COA。
