除了對環(huán)境（即空氣、純化水和設(shè)備表面）中的微生物進行檢測和計數(shù)外，更重要的是對有代表性的環(huán)境微生物分離物進行鑒定，以檢測變化的趨勢。環(huán)境中微生物類型的明顯變化可能表明偏離了環(huán)境正常控制水平。有幾種鑒定方法可用于鑒定環(huán)境中的微生物菌株。
鑒定方法的類型
為了鑒定環(huán)境中的微生物分離株，通常使用以下鑒定方法：
推定
表型
系統(tǒng)發(fā)育
為了進行分離株的推定鑒定，可以使用以下推定方法，例如選擇性/差異瓊脂（即Vogel-Johnson瓊脂，MacConkey瓊脂，Cetrimide瓊脂）上的顏色反應(yīng)，革蘭氏染色結(jié)果（例如，陽性或陰性以及形態(tài)——球菌、桿菌、酵母）和診斷測試（即，過氧化氫酶，凝固酶，溶葡萄球菌酶、桿菌肽、細胞色素氧化酶、氧化/發(fā)酵（O/F）試驗）。
為了對分離物進行表型鑒定，通常使用以下方法：生化鑒定試劑盒和MALDI-TOF質(zhì)譜。在生化鑒定試劑盒中使用碳利用和生化反應(yīng)來鑒定屬/種水平。MALDI-TOF質(zhì)譜法生成分離物的蛋白質(zhì)組指紋圖譜，以完成屬/種水平的鑒定。
對于細菌的鑒定，最常見的系統(tǒng)發(fā)育方法是16S rRNA測序。對于真菌的鑒定，最常見的系統(tǒng)發(fā)育方法是真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）和LSU-D2 rDNA測序。
革蘭氏染色
對環(huán)境細菌分離物的第一個鑒定步驟是根據(jù)菌落形態(tài)特征（如顏色、形狀、高度、表面和邊緣），將代表性分離物培養(yǎng)到無菌的大豆酪蛋白消化瓊脂培養(yǎng)基（SCDAM）上進行革蘭氏染色。然而，需要注意的是，使用R2A瓊脂或平板計數(shù)瓊脂回收的來自水的分離菌可能需要在低營養(yǎng)瓊脂上繼代培養(yǎng)，以獲得足夠的生長，因為它們受到營養(yǎng)壓力，可能無法在高營養(yǎng)培養(yǎng)基（如SCDAM）上生長。18至24小時分離物用于確定革蘭氏反應(yīng)和菌落形態(tài)（例如，桿菌、球菌或酵母）。如果使用16S rRNA測序或MALDI-TOF鑒定屬/種水平的分離物，則無需進行細菌革蘭氏染色。如果過度熱固定、過度脫色或使用培養(yǎng)時間超過24小時會獲得不正確的革蘭氏染色結(jié)果，很可能使用不正確的生化鑒定試劑盒，導(dǎo)致不正確的鑒定。
非芽孢革蘭氏陽性桿菌
放線菌屬(Actinomyces)、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、丹毒絲菌屬（Erysipelothrix）、李斯特菌屬（Listeria）、Cutibacterium和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）是非芽孢革蘭氏陽性桿菌，可在環(huán)境樣本中分離。放線菌可以從其他非孢子形成的革蘭氏陽性桿菌中區(qū)分出來，因為革蘭氏染色劑在顯微鏡下會顯示一個分支的菌絲網(wǎng)絡(luò)。此外，放線菌種類可以與瓊脂表面上的其他細菌菌落區(qū)分開來，因為它們往往非常密集和堅韌。為了推定區(qū)分棒狀桿菌、Cutibacterium、丹毒絲菌、李斯特菌和乳酸桿菌，可以進行以下生化測試：過氧化氫酶、硫化氫和運動性。棒狀桿菌屬、Cutibacterium和李斯特菌屬為過氧化氫酶陽性，而乳桿菌和丹毒絲菌屬為過氧化氫酶陰性。在TSI瓊脂上，丹毒絲菌屬呈陽性，乳桿菌屬呈陰性。棒狀桿菌和Cutibacterium是非能動的，而李斯特菌屬僅在室溫下是能動的（翻滾運動）。利用假定的生化反應(yīng)將Cutibacterium與其他非芽孢革蘭氏陽性桿菌分離是非常困難的。通過使用生化鑒定試劑盒、16S rRNA測序或MALDI-TOF分析，可以在物種水平上鑒定革蘭氏陽性桿菌菌株。
革蘭氏陽性球菌
放線菌在環(huán)境樣本中分離革蘭氏陽性球菌很常見。過氧化氫酶試驗可用于將革蘭氏陽性球菌分為兩組：過氧化氫酶陽性[葡萄球菌（Staphylococcus）、微球菌（Micrococcus）或考克氏菌（Kocuria）和過氧化氫酶陰性（腸球菌（Enterococcus）、鏈球菌（Streptococcus）或氣球菌（Aerococcus）]。為了將葡萄球菌從微球菌和考克氏菌中區(qū)分出來，可以使用溶葡萄球菌酶或桿菌肽敏感性試驗。在溶葡萄球菌酶敏感性試驗中，葡萄球菌屬敏感，而微球菌屬和考克氏菌耐受。在桿菌肽敏感性試驗中，葡萄球菌屬具有耐受性，而微球菌和考克氏菌具有敏感性。用常規(guī)的生化方法很難區(qū)分考克氏菌和微球菌。因此，這些微生物通常被稱為微球菌/考克氏菌。表型鑒定方法無法識別考克氏菌屬中的所有成員，因為生物化學(xué)和碳同化試驗的結(jié)果在考克氏菌屬的不同物種中顯示出異質(zhì)性。大多數(shù)生物化學(xué)數(shù)據(jù)庫并不包括所有分類的考克氏菌屬物種。目前，考克氏菌屬物種的鑒定通常采用16S rRNA測序和MALDI-TOF。凝固酶試驗用作推定試驗，以確定葡萄球菌分離物是否為金黃色葡萄球菌。然而，現(xiàn)在有七種公認的凝固酶陽性葡萄球菌：Staphylococcusaureus, S.intermedius, S.schleiferi subsp. coagulans, S. hyicus, S. lutrae, S. delphini, 和S. pseudintermedius。此外，現(xiàn)在還發(fā)現(xiàn)了凝固酶陰性的金黃色葡萄球菌分離株。不能假設(shè)所有凝固酶陽性的革蘭氏陽性球菌分離株都是金黃色葡萄球菌，而所有凝固酶陰性的革蘭氏陽性球菌分離株都不是金黃色葡萄球菌。建議使用生化鑒定試劑盒、16S rRNA測序或MALDI-TOF將所有的葡萄球菌分離物鑒定到物種水平，而不是使用凝固酶試驗。
在環(huán)境樣本中分離出過氧化氫酶陰性的革蘭氏陽性球菌是罕見的，但也可能發(fā)生。過氧化氫酶陰性的革蘭氏陽性球菌可分離為氣球菌、腸球菌和鏈球菌。由于氣球菌類似于血液瓊脂平板上的α-溶血性鏈球菌，因此很難通過推定鑒定，而且僅通過生化檢測也很難進行鑒定。推定的生化測試，如視黃素、桿菌肽、6.5% NaCl中的生長、膽汁七葉皂苷水解和馬尿酸水解，可用于分離腸球菌和鏈球菌。為了在屬/種水平上鑒定氣球菌，建議使用16S rRNA測序或MALDI-TOF。對于腸球菌和鏈球菌，使用生化鑒定試劑盒、16S rRNA測序或MALDI-TOF。
革蘭陰性桿菌
革蘭氏陰性桿菌可在環(huán)境樣品中分離。對于推定的生化測試，氧化酶測試用于確認細胞色素C氧化酶的存在，以區(qū)分氧化酶陽性（ox+）和氧化酶陰性（ox-）群的革蘭氏陰性桿菌。推定氧化-發(fā)酵（O/F）試驗可用于確定革蘭氏陰性桿菌是否能通過發(fā)酵或有氧呼吸（氧化）代謝葡萄糖，從而將氧化酶陽性革蘭氏陰性桿菌分離為氧化菌[即假單胞菌(Pseudomonas)、伯克霍爾德菌（Burkholderia）、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)和棲稻黃色單胞菌(Flavimonas oryzihabitans)]，發(fā)酵菌[弧菌(Vibrio)、氣單胞菌(Aeromonas)、發(fā)光桿菌（Photobacterium）和鄰單胞菌屬(Plesiomonas)]和陰性菌[產(chǎn)堿菌（Alcaligenes）和莫拉氏菌屬(Moraxella)]以及氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌分為氧化菌[即不動桿菌屬（Acinetobacter）、淺黃色假單胞菌(Pseudomonas luteola)和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stentrophomonas maltophilia)和發(fā)酵菌（腸桿菌科）]。根據(jù)這兩項生化推定試驗的結(jié)果，可使用適當?shù)纳b定試劑盒確定屬/種水平的分離物鑒定。此外，16S rRNA測序或MALDI-TOF分析也可用于鑒定屬/種水平的菌株。
霉菌分離物
在環(huán)境樣品中分離到霉菌是很常見的。表型和系統(tǒng)發(fā)育鑒定方法可用于從物種水平上鑒定霉菌分離物。霉菌的表型鑒定方法如下：宏觀和微觀特征（傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法）、Biolog FF MicroPlateTM和MALDI-TOF。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法基于分離物的宏觀（群體）特征和微觀特征，用于確定屬/種的鑒定。關(guān)鍵的宏觀特征包括顏色、紋理、反向顏色的使用以及可擴散顏料的存在。關(guān)鍵的微觀特征包括菌株的菌絲類型、孢子類型和生殖結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法在鑒定霉菌時通常缺乏特異性，并且可能耗時。根據(jù)形態(tài)結(jié)構(gòu)，在屬/種水平上鑒定霉菌是主觀的。Biolog FF MicroPlateTM利用基質(zhì)氧化產(chǎn)生的顯色（四氮唑還原）和真菌生長產(chǎn)生的濁度，提供一種特征反應(yīng)模式或指紋，用于從物種水平識別霉菌。MALDI-TOF生成霉菌的蛋白質(zhì)組指紋，用于確定霉菌分離物的物種水平鑒定。但是，MALDI-TOF的商業(yè)數(shù)據(jù)庫仍需要改進，因為數(shù)據(jù)庫覆蓋率不足。一些研究機構(gòu)使用內(nèi)部數(shù)據(jù)庫作為補充。
對于霉菌的系統(tǒng)發(fā)育鑒定方法，有兩種不同的方法：對大亞基核糖體DNA(D2 LSU）的D2區(qū)域進行rDNA測序，以及對一個或兩個內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）進行測序。ITS2比D2擴增片段DNA序列具有更多的變異性，因此提供了更高的特異性，也為真菌鑒定提供了更高的分辨率。在無法使用D2 LSU序列獲得物種級鑒定的情況下，通常可以使用ITS測序獲得物種級鑒定。一般來說，ITS序列之間的分化程度更高。在某些情況下，單獨的D2 LSU測序無法區(qū)分不同但密切相關(guān)的屬，或者無法區(qū)分更大范圍的密切相關(guān)屬，ITS測序卻可以成功地進行物種級鑒定。
酵母分離物
酵母通常存在于環(huán)境樣本中，革蘭氏染色呈陽性。生化鑒定試劑盒和MALDI-TOF分析等表型方法可用于在屬/種水平上鑒定酵母菌株。推定生化試驗可用于將酵母分離物鑒定為白色念珠菌：選擇性/差異性瓊脂，例如鉍葡萄糖甘氨酸酵母(BIGGY)瓊脂、各種顯色瓊脂，以及用于檢測以下兩種酶的存在的快速生化試驗：L-脯氨酸氨基肽酶和ß-半乳糖苷酶。大亞基(LSU)D2區(qū)和ITS2區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育rDNA測序也可用于確定酵母分離物屬/種水平的鑒定。
幾個特例
（1）放線菌屬、棒桿菌屬和Cutibacterium。環(huán)境中分離菌，如放線菌屬（Actinomyces）、棒桿菌屬（Corynebacterium）和Cutibacterium，很難進行革蘭氏染色，因為它們的細胞壁在細胞分裂過程中對破裂敏感，導(dǎo)致它們在革蘭氏陽性的同時染色革蘭氏陰性，結(jié)果是革蘭氏可變反應(yīng)。為確認革蘭氏可變微生物的革蘭氏染色結(jié)果，建議進行KOH試驗。
（2）芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬。芽孢桿菌和類芽孢桿菌屬是內(nèi)生孢子形成的革蘭氏陽性桿菌，是常見的環(huán)境分離菌。一般來說，由于難以使用生物化學(xué)或系統(tǒng)發(fā)育鑒定方法區(qū)分該屬的某些成員，芽孢桿菌物種無法鑒定到屬/種水平。例如，很難基于生物化學(xué)方法區(qū)分出蠟樣芽孢桿菌群的單個成員。此外，基于系統(tǒng)發(fā)育方法也很難解決蠟樣芽孢桿菌群的鑒定問題。炭疽桿菌、蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌的16S rRNA基因序列具有高度的序列相似性（>99%）。在16S rDNA序列上，炭疽桿菌和蠟樣芽胞桿菌的某些菌株只有一個核苷酸不同，也有報道稱炭疽桿菌的序列與蠟樣芽孢桿菌的序列相同。
很難從生化水平上將芽孢桿菌和類桿菌物種彼此分離。可能必須使用16SrDNA基因型和表型鑒定方法的組合來將分離物鑒定為擬桿菌物種。
結(jié) 論
有許多不同的方法可用于從屬/種水平上鑒定回收的環(huán)境微生物分離物，但測序方法（16S rDNA，ITS，全基因組測序）無疑可以提供最精準的鑒定結(jié)果。
文獻原文鏈接：Identificationof Recovered Environmental Microbial Isolates | American Pharmaceutical Review- The Review of American Pharmaceutical Business & Technology
