藥品雜質對照品是藥物質量研究的關鍵因素，然而有些雜質對照品價格昂貴，例如25mg瓶裝的化合物往往需要數萬元，這極其加大了企業的研發成本。雜質對照品價格之所以昂貴的原因一方面在于合成和提純難度大、物料和人工成本等，另一方面在于某雜質為自身工藝所產生，含量低且結構未知，市場上購買不到。本文主要討論未知結構且含量微小的雜質對照品的制備獲取方法-富集法，文末有實例分享，歡迎大家探討。
藥物雜質主要來源于兩方面：合成過程和貯藏過程中生成的雜質。對于質量研究中出現的某個雜質，通過合成過程的雜質譜分析，仍無法推導其可能的結構式，且含量微小時，此時只能通過“富集法”。“富集法”需要耗費一定的物料、試劑、人工和時間成本，如何提高富集法的效率，值得思考。
1、 富集法的目的和方法
富集法的目的在于運用各種分離方法，從混合物中富集未知結構且含量微小的化合物。因此，富集法第一步在于目標混合物的獲取。一般情況下，根據該雜質的來源：合成過程或貯藏過程。對于合成過程中產生的雜質，通常參照工藝路線，改變反應物料比和反應溫度、時間等，收集獲得的中間體或者濾液進行分離；而對于貯藏過程產生的雜質，則參考穩定性影響因素試驗，采用高溫、高濕、酸堿、氧化等破壞條件驗，從而得到目標混合物。
富集法第二步在于綜合運用各種分離方法（結晶、萃取、制備色譜等），富集得到目標化合物。由于本文主要討論含量微小雜質的富集，從提升工作效率方面考慮，下文主要討論制備色譜法在富集法的開發應用，包括：反相制備色譜和正相制備色譜。
2、 富集法的方法開發過程
2.1分析目標混合物的有關性質
利用液質聯用技術，分析混合物中目標化合物的分子量和分離情況，了解該化合物的親酯親水性，考察目標雜質峰和附近的色譜峰在不同的流動相（酸堿性或緩沖鹽）中的分離度差異。配制目標雜質的混合物溶液，考察在冰浴或室溫過夜放置的穩定性，為后期收集的制備溶液的去除提供參考依據。
2. 2 對于目標混合物的預處理
目標混合物預處理的目的是為了去除影響分離純化的其他雜質峰，從而提高分離效率。例如參照工藝合成過程得到的是反應液時，由于主成分比例高，制備色譜分離時，容易濃度超載，進而形成寬峰和拖尾，降低分離度。因而優選通過析晶法去除主產物或者收集濃縮母液。而對于強制降解試驗中的酸堿或氧化法，則通常需要調節Ph至中性或淬滅氧化劑。另外，可以加入有機相萃取反應液，考察目標雜質在有機相和水相的溶解度差異，初步提純。
2.3制備色譜方法的選擇
制備色譜方法包括反相制備色譜和正相制備色譜，反相制備色譜流動相中的水相常加入酸或緩沖鹽（例如：甲酸、乙酸銨），有機相則常使用甲醇或乙腈，適用于非極性或弱極性化合物的分離。正相制備色譜流動相都是有機相，可自由選擇正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、乙醇等兩相或多相混合，適用于極性化合物和異構體的分離。親水混合物優選反相制備色譜，而親酯混合物兩者皆可使用，有著不同的選擇性。需要注意的是，正相制備色譜，不同有機相混合洗脫時，出峰順序可能會有所不同。
2.4制備色譜方法的開發
2.4.1 初步快速分離富集
由于雜質含量微小且通常成分復雜，一次分離往往難以得到純度合格的雜質對照品。因而分離純化的第一步是快速的初步富集，即通過建立反相或正相制備方法，優選等度洗脫，以“濃度超載”或“體積超載”連續進樣，收集目標雜質對應的色譜峰段。需要注意的是，對于成分復雜者，此種連續進樣法，色譜峰型可能相當難看，我們需要分段收集送檢，定位到目標雜質所在位置即可。
對于初步富集得到的制備液體，往往體積比較多，需要濃縮除去有關溶劑。從“2.1分析目標混合物的有關性質”中，我們可以得到目標雜質的穩定性和親水親酯性。對于制備溶液，如果是采用正相制備色譜的話，低溫減壓旋除有機溶劑即可。如果是反相制備色譜的話，由于含有水相，分以下兩種情況操作。親酯性的話則低溫減壓旋除有機相，加入其它不溶于水的有機相（乙酸乙酯或二氯甲烷）萃取，低溫減壓旋除有機溶劑。親水性且雜質穩定的話，則減壓旋除大部分水相；親水性且雜質不穩定的話，可以通過冷凍干燥法濃縮。
2.4.2進一步細分純化
得到初步的分離富集濃縮液體后，目標雜質的含量比往往提高不少。此時需要進行細分純化。由于經過初步分離后，主成分已經去除或者大部分去除。制備液相方法的開發可以在初步富集方法的基礎上進行調整，加大進樣而不受主成分的寬峰和拖尾影響。此過程主要考慮的是目標雜質的分離度，以得到純度合格的目標雜質。通過調節洗脫梯度，水相調節劑的添加（酸堿、緩沖鹽），有機相的選擇（單一或復配）正相溶劑的選擇（兩相或者多相）。值得一提的是，由于正相制備色譜的特殊選擇性，對于難以分離的同分異構體或者極性相近者，往往有意想不到的分離度。
2.4.3 純化分離后處理
純化分離結束后，去除溶液即可得到目標雜質。對于不同的親水親酯性，不同的雜質穩定性，具體操作請參考“2.4.1”制備液體的濃縮去除。需要注意的是，對于反相制備色譜水相加入緩沖鹽分離的，需要采用不含鹽的水相-有機相再次制備除去緩沖鹽。最后就是基于大部分雜質的熱不穩定性，整個純化分離過程，盡可能冰浴低溫保存，或者更低溫度保存。
實例分享：某抗生素雜質的制備富集過程
目標雜質混合物的獲取方法
影響因素試驗發現，該雜質在高溫高濕下有生成的趨勢，然而通過改變溫度和濕度，該雜質含量最多約0.5%左右，且結構無法推導出來。
分析目標混合物的有關性質
通過液質聯用，得知該化合物分子量M，主成分約95%，目標雜質峰附近有多個雜質峰，成分較復雜。目標雜質偏親水性，反相洗脫出峰快。該雜質穩定，耐熱。
對于目標混合物的預處理
往破壞降解物加入水和乙酸乙酯混合溶液，萃取分液，收集水相。
初步快速分離富集
由于目標雜質親水性，首選反相制備色譜。參照反相分析方法，調節水相和有機相，建立等度洗脫方法，快速分離富集。
進一步細分純化
優化反相制備色譜法，梯度洗脫，得到純度合格的目標雜質制備液。
純化分離后處理
減壓濃縮除去水相和有機相后，得到目標雜質，低溫保存，富集完成。
總結：有些藥物雜質價格昂貴，需要委外定制合成，加大企業研發成本。此種情況下，富集法或許是一種比較好的選擇。如何更好的提升這種微量雜質的富集效率，值得大家探討。例如優化的色譜方法的建立等等。
