眾所周知，口服固體制劑的溶出方法開發(fā)是個(gè)爭(zhēng)論不休的大課題，如何以體外溶出行為評(píng)價(jià)體內(nèi)行為，我們今天姑且不聊，主要聊一聊溶出度與溶出曲線方法學(xué)驗(yàn)證的具體內(nèi)容。而溶出的檢測(cè)方法常用的是紫外-可見分光光度法(UV法)和高效液相色譜法(HPLC法)兩種。
本文主要適用于口服固體制劑以HPLC法檢測(cè)溶出度和溶出曲線需要進(jìn)行的方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，UV法需要驗(yàn)證的內(nèi)容大同小異，可根據(jù)實(shí)際情況加以調(diào)整，大體原則不變，現(xiàn)將具體內(nèi)容匯總?cè)缦拢?/span>
1.色譜條件的確定
溶出度的檢測(cè)方法，首選以含量測(cè)定方法為原點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化。若含量測(cè)定方法合適，則可與其方法一致，省去一部分開發(fā)內(nèi)容。但當(dāng)含量測(cè)定采集時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，建議優(yōu)化方法，使溶出采集時(shí)間盡量短，否則一條溶出曲線的測(cè)定時(shí)間將非常漫長(zhǎng)，在穩(wěn)定性過程中的檢測(cè)將更令人等到頭禿，勞民傷財(cái)?shù)氖聝涸郾M量不干。
值得關(guān)注的是，由于溶出曲線各種介質(zhì)與含量測(cè)定所采用的溶劑不同，供試品溶液濃度也并不一致，故峰型柱效可能會(huì)有變化，故開發(fā)過程中應(yīng)關(guān)注系統(tǒng)適用性要求。
另外有一種情況，主成分在某種溶出介質(zhì)中很不穩(wěn)定，產(chǎn)生降解雜質(zhì)，需要將降解雜質(zhì)含量與溶出量加和計(jì)算，此時(shí)的測(cè)定方法應(yīng)能將降解雜質(zhì)峰與主成分峰完全分離，方不影響測(cè)定結(jié)果。
2.分析方法的驗(yàn)證
按照慣例，先上一個(gè)匯總表概括說明驗(yàn)證內(nèi)容：
注：測(cè)定中各溶出介質(zhì)均需進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證（耐用性可酌情減少實(shí)驗(yàn)，有時(shí)僅考察標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)就具有一定的代表性了）。
下面，將方法學(xué)驗(yàn)證中的各項(xiàng)試驗(yàn)要求展開詳述。
2.1專屬性
目的：考察空白溶劑、空白輔料與待測(cè)主成分峰之間的分離情況。
空白溶劑、對(duì)照品溶液、供試品溶液：按擬定標(biāo)準(zhǔn)配制。
空白輔料溶液：空白輔料按處方比例混合后，按擬定標(biāo)準(zhǔn)配制（需考察膠囊殼等基質(zhì)）。
需考慮圖譜中肉眼可見的較大降解雜質(zhì)與主成分的分離情況，必要時(shí)加和計(jì)算溶出量。溶出度不要求考慮普通雜質(zhì)與主成分的分離情況，也不要求進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗(yàn)。
2.2溶液穩(wěn)定性
目的：考察對(duì)照品溶液和供試品溶液配制后的穩(wěn)定時(shí)間，為工藝驗(yàn)證、批檢驗(yàn)、穩(wěn)定性考察以及上市后的溶出度與溶出曲線測(cè)定提供依據(jù)。
系統(tǒng)適用性溶液視情況考察，對(duì)照品溶液與供試品溶液必須考察。
注意：溶液穩(wěn)定性的考察時(shí)間也應(yīng)針對(duì)具體情況，如采集時(shí)間較長(zhǎng)，考察時(shí)間也應(yīng)延長(zhǎng)，目的是使后續(xù)檢驗(yàn)更方便。當(dāng)溶液不穩(wěn)定時(shí)，重復(fù)考察避光條件或冷藏條件下是否穩(wěn)定，視情況而選擇規(guī)定溶液穩(wěn)定性的考察時(shí)間。
2.3定量限
目的：為確保分析方法測(cè)定供試品含量的靈敏度。
定量限的概念：是指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度。定量限體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量檢測(cè)能力。
將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，當(dāng)稀釋至信噪比約為10時(shí)，此時(shí)濃度可作為定量限濃度。
溶出方法學(xué)并不強(qiáng)制要求做檢測(cè)限。
注意：定量限結(jié)果受色譜系統(tǒng)影響較大，如色譜柱、流動(dòng)相、色譜儀的狀態(tài)，甚至次日試驗(yàn)的結(jié)果會(huì)與前一天不同，在這種情況下，若定量限濃度較低，應(yīng)換用色譜系統(tǒng)再次測(cè)定，以確保方法的靈敏度。
2.4線性與范圍
目的：在規(guī)定的濃度范圍內(nèi)，測(cè)定響應(yīng)值（峰面積）與待測(cè)組分濃度呈比例關(guān)系的程度。
敲黑板——峰面積與濃度呈線性關(guān)系，是外標(biāo)法的前提。
配制一份對(duì)照品母液，從中稀釋配制成一系列不同濃度的線性溶液，至少制備5份（建議濃度點(diǎn)的總數(shù)為奇數(shù)），以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)對(duì)待測(cè)物的濃度作圖，檢查是否呈良好的線性關(guān)系。
溶出度的線性溶液濃度要求：推薦為20%~150%。對(duì)于緩釋制劑的溶出度，推薦為0~150%。注意線性溶液的最低濃度應(yīng)大于定量限濃度，并應(yīng)涵蓋溶出曲線測(cè)定的最低濃度點(diǎn)。線性的濃度點(diǎn)盡量均勻分布。
2.5儀器精密度
目的：為保證儀器每次所測(cè)對(duì)照品溶液峰面積均一致，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，設(shè)計(jì)儀器精密度試驗(yàn)。
取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。考察保留時(shí)間和峰面積的RSD%。
2.6回收率
目的：考察采用擬定方法測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，也叫做回收率試驗(yàn)。用至少測(cè)定6份結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，或設(shè)計(jì)3種不同濃度，每個(gè)濃度平行配制3份。
按照擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)配制空白溶劑、對(duì)照品溶液。
回收率供試品溶液：按處方比例混合的空白輔料+主成分對(duì)照品，再按照擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)配制溶液。
不同于含量測(cè)定，溶出曲線過程中會(huì)涉及到較低濃度點(diǎn)，故回收率推薦設(shè)計(jì)較低濃度，保證在溶出行為測(cè)定的整個(gè)過程中，該方法都是較為準(zhǔn)確的。回收率驗(yàn)證的范圍必須囊括100%濃度水平。濃度范圍一般要求為限度的±20%，高濃度點(diǎn)可適當(dāng)調(diào)整至110%。
回收率結(jié)果報(bào)告表格推薦內(nèi)容如下：
2.7耐用性
針對(duì)耐用性，若涉及到的各溶出介質(zhì)都去做一遍，工作量就過于龐大了。故推薦至少考察標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)中的耐用性即可，其他介質(zhì)視情況考察。
（1）溶出方法的耐用性
目的：考察溶出條件發(fā)生微小變化時(shí)，各時(shí)間點(diǎn)溶出量的變化情況。
還是列表說明推薦的變動(dòng)條件：
根據(jù)品種特點(diǎn)考察耐用性，推薦但不僅限于上述變動(dòng)條件。還有很多需要注意的方面，比如表面活性劑的濃度和不同廠家、不同緩沖液濃度、配制介質(zhì)的水的脫氣條件等，都是需要研究者在試驗(yàn)過程中予以關(guān)注的細(xì)節(jié)。
（2）測(cè)定方法的耐用性
這一個(gè)模塊的內(nèi)容與含量測(cè)定耐用性要求基本一致。
目的：考察色譜條件發(fā)生微小變化時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。
按照擬定標(biāo)準(zhǔn)配制空白溶劑、對(duì)照品溶液和供試品溶液（系統(tǒng)適用性溶液視情況配制），計(jì)算不同條件下供試品的含量測(cè)定結(jié)果，關(guān)注系統(tǒng)適用性是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求（有時(shí)方法中并不擬定配制系統(tǒng)適用性溶液，而是規(guī)定主峰理論板數(shù)和拖尾因子等，也要相應(yīng)關(guān)注和統(tǒng)計(jì)）
同樣放一張表格，將耐用性試驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果要求直觀呈現(xiàn)如下：
耐用性考察的內(nèi)容可能還有很多，請(qǐng)各位根據(jù)實(shí)際情況增減。另外，有時(shí)幾個(gè)條件同時(shí)變化的情況下是否耐用，也是需要考察的。但考察疊加條件工作量較大，可自行選擇較為重要的條件進(jìn)行考察。耐用性試驗(yàn)時(shí)，觀察峰型和結(jié)果的變化趨勢(shì)，后續(xù)檢驗(yàn)一旦出現(xiàn)問題，可以通過現(xiàn)象推測(cè)偏差原因，及時(shí)解決問題。
注意：變化不同色譜條件時(shí)，切記根據(jù)需要延長(zhǎng)采集時(shí)間。
當(dāng)變動(dòng)條件后測(cè)定結(jié)果與正常條件基本一致，且系統(tǒng)適用性指標(biāo)符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，即可下測(cè)定方法耐用的結(jié)論。
2.8批內(nèi)均一性和批間均一性
在海棠君看來，這兩項(xiàng)指標(biāo)既是檢驗(yàn)企業(yè)產(chǎn)品的標(biāo)桿，同時(shí)也是檢驗(yàn)溶出方法是否精密的標(biāo)桿。
批內(nèi)均一性：取同一批次產(chǎn)品的12個(gè)劑量單位（有時(shí)6個(gè)劑量單位也能夠滿足考察要求，比如快速溶出等情況），測(cè)定溶出曲線，計(jì)算各取樣時(shí)間點(diǎn)的RSD值。其中，早期的一些取樣時(shí)間點(diǎn)（如5min），要求RSD≤20%；其他時(shí)間點(diǎn)，要求RSD≤10%。
批間均一性：取不同批次產(chǎn)品的12個(gè)劑量單位（有時(shí)6個(gè)劑量單位也能夠滿足考察要求，比如快速溶出等情況），測(cè)定溶出曲線，比較各批次的溶出曲線是否相似。
3.不得不提到的注意事項(xiàng)
3.1質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)寫法
中國(guó)藥典2015年版二部中所載各品種，即便是緩釋制劑，對(duì)這一項(xiàng)檢查也不再寫成“釋放度”而是寫成“溶出度”，因此在撰寫藥典版質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，推薦按照藥典規(guī)范寫法。
3.2方法學(xué)驗(yàn)證的范圍
驗(yàn)證范圍包括但不僅包括該品種的各常規(guī)介質(zhì)。
若該制劑涉及到劑量?jī)A瀉的考察，應(yīng)進(jìn)行加入一定量乙醇介質(zhì)中的溶出方法學(xué)驗(yàn)證。
若需考察該產(chǎn)品在生物介質(zhì)中的溶出行為，則應(yīng)進(jìn)行生物介質(zhì)中的溶出方法學(xué)驗(yàn)證。
總之，有的放矢，有據(jù)可依，檢測(cè)做了什么，方法就需驗(yàn)證什么。
3.3配制過程中的溶劑問題
當(dāng)主成分在相應(yīng)溶出介質(zhì)中難溶時(shí)，在方法學(xué)驗(yàn)證中可使用少量有機(jī)溶劑先使其溶解（線性、回收率等試驗(yàn)），再用相應(yīng)溶出介質(zhì)稀釋定容，但最終進(jìn)樣分析的供試品溶液中，有機(jī)溶劑的比例應(yīng)不超過總體積的5%。
