摘  要 / Abstract

 

發酵類中藥歷史悠久，但目前對其研究尚不夠深入，質量控制標準有待完善提高。本文對發酵類中藥的物質基礎研究、分類、質量控制現狀進行了綜述，旨在闡明目前發酵類中藥質量控制中存在的問題，為后續質量控制和標準的提高提供參考。

Fermented traditional Chinese medicine (TCM) has a long history,but research in this field is not sufficient and the quality control standards need to be improved.This article reviews studies on the material basis,classification and quality control status of fermented TCM,aiming to clarify current problems in the quality control of fermented TCM,and provide insights for further improving quality control standards.

 

 

 

關 鍵 詞 / Key words

 

發酵；中藥；質量控制；研究進展

fermentation; traditional Chinese medicine; quality control; research progress

 

中藥發酵屬于炮制方法的一種，是指取待炮制品加規定的輔料拌勻后，制成一定形狀，置適宜的濕度和溫度下，使微生物生長至其中酶含量達到規定程度，曬干或低溫干燥[1]。中藥的發酵炮制方法始見于《神農本草經》。

 

發酵類中藥既可以直接作為飲片用于臨床，也可以作為眾多中成藥的原料或處方組成，其真偽優劣直接影響臨床效果。發酵類中藥應用廣泛，種類繁多，但由于各地處方及發酵工藝不統一、缺少發酵類中藥質量的評價方法，導致發酵類中藥產品質量參差不齊。本文對發酵類中藥物質基礎研究、分類、質量控制現狀進行了綜述，闡述發酵類中藥現存問題，以期為該類產品質量控制研究提供參考。

 

01  物質基礎研究

 

發酵類中藥可能是通過轉化的化學成份、菌種代謝產物等發揮作用，針對這些物質基礎已有許多相關報道。

 

1.1 消化酶

 

發酵時空氣中的水分子是微生物生長的溫床，在其發揮催化作用的過程中會產生大量的消化酶。消化酶種類繁多，有纖維素酶系、蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、脂肪酶等。目前在發酵類中藥研究中，對消化酶的研究較多。整理常見發酵類中藥產生酶的種類，如表1所示。

 

 

1.2 化學成份轉化降解

 

1.2.1 低聚糖

 

發酵類中藥的低聚糖來源有2條途徑。途徑1：對于米面為基質的曲類，發酵過程中會產生淀粉酶、糖化酶等消化酶，酶作用于底物產生葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖等低聚糖。途徑2：在發酵過程中，原藥材中某些糖苷類成份被降解，失去糖配基。張超[12]采用苯酚-硫銨法測定不同發酵時間的半夏曲中總多糖含量，結果顯示，含量先增加后減少，原因是發酵初期大分子物質被產生的酶逐步酶解成低聚糖，后期微生物消耗產生的糖。劉洋等[13]、Magrini等[14]采用復合益生菌分別對王不留行、益母草、黃芪進行發酵，測定多糖含量，結果顯示，多糖含量均增加。

 

1.2.2 脂肪酸

 

當發酵類中藥的原藥材含有較多的油脂及不溶性酯類時，產物會包含長鏈脂肪酸及小分子酸性物質，如六神曲發酵后酸度增加[15]、半夏曲中甘草次酸含量會隨發酵而升高[16]等。但對于酸類物質的具體來源及機制暫無明確的研究闡述，僅有結論，后續可作為研究方向。

 

1.2.3 活性成份轉化

 

林王敏等[17]、王麗芳等[18]、杜晨暉等[19]分別對淡豆豉、六神曲、酸棗仁發酵前后成份轉化進行研究，結果顯示，均存在黃酮苷類物質脫糖基轉化為苷元的現象，發酵后苷元含量上升，為發酵類中藥成份尋找質量控制指標提供了參考思路。另外，可以利用微生物將苷轉化為苷元這一作用，人工制備不易得到的苷元，如王永宏[20]通過微生物發酵法實現了梔子中有效成份梔子苷元京尼平的制備。

 

除苷向苷元轉化外，還可利用發酵提高其他種類有效成份的轉化。如甘草發酵后甘草酸轉化為甘草次酸[21]、黃芪經保加利亞乳桿菌發酵后總黃酮和總皂苷含量增加[22]、將人參中含量較高的人參皂苷Rb1轉化為生物活性更高的稀有人參皂苷C-K[23]等。因此，發酵可作為輔助中藥提取、提高中藥有效成份利用率的有效方法。

 

1.2.4 有毒物質降解

 

發酵作為炮制技術的一種，具有增效減毒的作用。發酵類中藥化風丹中生物堿類成份既是指標成份也是毒性成份。馬奮剛等[24]測定發酵前后化風丹中次烏頭堿、烏頭堿、新烏頭堿3種雙酯型生物堿及苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿3種單酯型生物堿的含量，結果表明，發酵后毒性較大的雙酯型生物堿含量下降，而單酯型生物堿含量上升，提示可能存在2種生物堿間的轉化。朱舟等[25]利用天南星與白僵菌雙向發酵得到抗驚厥藥效不變、半數致死量(LD50)增大2倍、毒性較小的產物，達到減毒的目的。

 

1.3 菌種變化

 

微生物是發酵炮制的核心，發酵過程中微生物的種類、數量、優勢菌種等均處在動態變化中，對于發酵過程中菌種變化的監測有利于篩選優勢菌并進行分離鑒定，為后期實現純種菌發酵及質量控制提供理論基礎。朱海針等[26]、龍凱等[27]、陳彥琳等[28]分別采用Biolog微生物自動鑒定系統、聚合酶鏈式反應(PCR)技術、基因測序技術動態監測不同發酵時間點淡豆豉、半夏曲、六神曲中微生物種類的變化，總結菌種變化的規律并確定優勢菌種，為后續該類中藥實現純種菌發酵提供參考。

 

上述對于微生物的鑒定均采用傳統分離和高通量測序技術，該方法前期處理耗時較長且鑒定結果需人工整理，無法直觀給出。目前，隨著分析技術的不斷發展，質譜技術以其靈敏度、準確度高且能進行結構鑒定等優點應用日益廣泛，在微生物鑒定領域，基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)、敞開式離子化質譜(AI-MS)技術以其分析時間短、檢測成本低、信息直觀、易于操作等優點逐漸成為微生物檢測的重要方式[29-32]。但目前未見該技術應用于發酵類中藥的微生物群落鑒定，可作為日后研究的方向。

 

1.4 真菌毒素

 

真菌毒素是由真菌產生的次級代謝產物，主要包括霉菌毒素和蕈菌毒素，易產生致癌、致突變作用。為避免真菌毒素對用藥安全的影響，應嚴格檢測和控制真菌毒素的含量，發酵類中藥更應注重該安全性指標的控制。李汶等[33]、張雪輝等[34]分別采用酶聯免疫吸附測定法、高效液相色譜法與熒光光度法檢測常見中藥淡豆豉、生建曲、六神曲及含有六神曲的中成藥保和片、含有淡豆豉的中成藥銀翹解毒片中黃曲霉毒素含量，結果顯示，藥材中黃曲霉毒素B1含量差距較大，提示發酵類中藥有可能被黃曲霉毒素污染，應加強檢測。另外，發酵類產品不應只關注黃曲霉毒素，如赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、肉毒毒素等作為常見的真菌毒素，在發酵類中藥中卻鮮有報道[35-37]。

 

02  發酵類中藥的分類

 

2.1 按發酵方式分類

 

按發酵方式分為傳統自然發酵和現代純種菌發酵。傳統自然發酵是指在適宜溫濕度條件下，借助空氣中存在的菌種發泡或產生霉衣。目前，對傳統自然發酵中“適宜”二字的定義并不具體，但發酵順利與否受溫濕度條件影響較大。同時，傳統自然發酵終點的辨別仍需人工經驗輔助，摻雜了主觀臆斷的可能。另外，參與傳統自然發酵的微生物種類和數量存在較大的不確定性。以上因素均不利于統一的質量控制。隨著現代分析技術的發展，微生物的分離鑒定越來越普遍，這使優勢菌種的選擇和純種菌發酵成為可能?，F代純種菌發酵嚴格控制發酵溫濕度、參與催化分解作用的微生物種類和數量等，從發酵原藥材的挑選、菌種的選擇、發酵環境的優化等方面保證發酵過程的動態控制[38]。與傳統自然發酵相比，現代純種菌發酵能夠更好地進行質量控制，但目前市場上大多數發酵類中藥仍采用傳統自然發酵方式。

 

2.2 按發酵技術手段分類

 

2.2.1 固態發酵

 

固態發酵是指在固態的營養基質上進行微生物發酵的過程，基質中幾乎無自由流動的水，起源于古代炮制技術中的制曲工藝，包括藥材預處理、微生物選擇、發酵參數優化等步驟[39]。該發酵技術操作簡便、設備和場地要求較低，但發酵環境處于開放狀態、發酵終點的確定依賴經驗、參與發酵的菌種不固定且未對基質進行滅菌[40]，導致成品存在批間差異，市場上流通的產品質量參差不齊。六神曲、建曲、半夏曲、淡豆豉、百藥煎等均屬于固體發酵。

 

2.2.2 液體發酵

 

液體發酵是在融合了抗生素制備工藝的基礎上發展起來的，將優勢菌種的菌絲接種在培養基上，發酵產物為菌絲體和次級代謝產物。該發酵技術解決了固體發酵中混合菌株開放式發酵的問題，可實現大規模生產，提高生產效率，成為發酵類中藥大生產的主要方式。如利用真菌糙皮側耳制備的黨參發酵液鎮痛效果顯著提高[41]、積雪草經黑曲霉JH-2菌株液體發酵后積雪草酸質量分數提高3倍[42]等。

 

2.2.3 雙向發酵

 

雙向發酵技術起源于固態發酵，區別在于將固態發酵中農副產品等營養基質以具有一定活性成份的藥材或藥渣替代，并接種優選菌種進行發酵的制備手段[43]。如利用毛霉、曲霉、青霉等微生物轉化人參皂苷、葛根素、黃芩苷等[44]。雙向發酵技術實現了中藥的二次利用，增加了中藥有效成份的利用率，提高藥效，目前研究廣泛[45-46]，常見的紅曲為該類發酵技術所得。

 

2.3 按發酵基質分類

 

2.3.1 米面曲類

 

米面曲類中藥是以米面等營養物質為基質進行發酵的產物。作為發酵類中藥中最為常見的曲類，最早的記載可追溯到商周時期的《禮記》。以曲類形式入藥，最早見于東漢張仲景所撰《金匱要略》中的 “薯蕷丸”[47]。

 

目前，常見的米面曲類有六神曲、建曲、半夏曲、紅曲、沉香曲、采云曲等。其中，臨床需求量排名前三的分別為紅曲、建曲和六神曲[48]。米面曲類處方差異較大，有幾味藥材組成的如六神曲，也有幾十味藥材組成的如漳州神曲。由于米面曲類處方組成各地差異較大、生產工藝處于半工業化階段等原因，質量控制仍處于起步階段，市場上以次充好的質量問題大肆泛濫，長此以往，臨床需求萎縮、曲類中藥發展受阻等問題將不斷呈現。因此，統一米面曲類中藥的處方配比、規范生產工藝、制定質量控制方法、形成完善的質量標準迫在眉睫。

 

2.3.2 膽汁發酵類

 

膽汁發酵類中藥是以來源于豬、牛、羊、雞等的膽汁為基質、具有藥效的中藥為底物進行雙向發酵的產物，常見的有膽南星、體外培育牛黃、化風丹、膽黃連等[49-50]。其中，膽南星已作為發酵加工品收錄于《中國藥典》2020年版一部。目前，膽汁發酵類中藥的發展受制于膽汁來源不同，發酵工藝各異，發酵時間少則幾天多達數月，性狀的描述多為氣微腥味苦，受人為經驗影響等因素。未來需繼續發掘適用于膽汁發酵的藥材、對膽汁來源進行說明、規范發酵工藝，實現工業化大生產。

 

2.3.3其他類

 

除以米面等營養物質或膽汁作為發酵基質外，還有直接使用藥材不外加基質進行發酵的中藥，如淡豆豉、百藥煎、青黛、冬蟲夏草菌粉等。其中，淡豆豉已作為發酵加工品收錄于《中國藥典》2020年版一部，質量控制方法較為成熟。

 

03  質量控制現狀

 

查閱《中國藥典》、部頒標準、各省中藥飲片炮制規范中發酵類中藥的收錄情況可以發現，目前該類中藥仍多以性狀鑒別為主，大部分無統一的處方及工藝規范，缺乏量化的、體現藥效的、具有發酵類中藥特色的質控指標，質量控制技術手段和質量標準處于不成熟階段。本文將從以下2個方面對發酵類中藥的質量控制現狀進行綜述。

 

3.1 處方及工藝

 

處方比例和發酵工藝的不同，將會影響發酵類中藥的臨床療效。整理不同標準中常見發酵類中藥的處方及工藝，如表2所示。

 

 

 

 

3.2 質量控制方法

 

對于發酵類中藥，目前的質量控制方法主要包括性狀、鑒別、檢查等，如表3所示。

 

 

 

 

除《中國藥典》、部頒標準、各省中藥飲片炮制規范中有對發酵類中藥具體成份進行含量測定外，現代研究認為，消化酶是能反映發酵類中藥質量的指標[51-53]。目前，針對發酵類中藥酶活力測定方法按照原理主要分為2類：測定底物的消耗量和測定酶解產物的量。常用的方法有碘淀粉比色法、3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法、福林酚法、對-硝基苯磷酸鹽(pNPP)法、對-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)法、纖維蛋白平板法等?，F將有關報道匯總如表4所示。

 

 

 

04  總    結

 

4.1 統一處方組成，優化規范生產工藝

 

目前，發酵類中藥國家標準相對滯后，地方標準較多，且各地標準處方組成或配比不同、發酵方式及工藝參數不統一、質量控制技術和方法落后，直接影響了產品的質量和安全控制。其中，處方組成項中涉及的發酵用輔料尚無統一的來源及規格規定，如膽汁、黃酒、面粉等，應予以明確并制定質控標準。

 

另外，發酵類中藥在大生產中仍多采用固體發酵及傳統自然發酵的方式，而涉及優勢菌種、提高有效成份轉化、提高生產效率的液體發酵和雙向發酵技術僅停留在實驗室成果階段，并未規?；D化應用。因此，后續應關注優勢菌種的篩選及高效發酵技術手段和生產工藝的開發應用。

 

4.2 開展發酵過程及物質基礎研究

 

除了配方本身的物質基礎，發酵類中藥由于微生物的參與，會具有產生消化酶及次生代謝產物、原成份發生轉化降解、優勢菌種逐漸顯現并且引入真菌毒素對用藥安全性產生威脅等特點。目前對發酵類中藥消化酶的研究較多，但對于微生物次生代謝產物及化學成份轉化的研究不夠深入，應加強發酵機制和物質基礎等方面的深入研究。

 

4.3 開展功效機制及質量評價方法研究

 

發酵類中藥雖然臨床使用非常廣泛，但因物質基礎及作用機制研究不夠深入，質量控制指標有待進一步明確，質量控制技術和方法有待進一步提高和完善。建議加強潛在質量控制指標的研究，從消化酶和化學成份兩方面入手，在作用機制研究的基礎上，尋找具有發酵類中藥特色且真正能反映質量的控制指標。同時應關注安全性控制指標，特別對因生產過程控制不規范導致菌種變化及有毒代謝產物如真菌毒素等的控制。

 

總之，發酵類中藥的研究、生產、使用和質量管控仍處于較為初級的階段，因其歷史悠久，臨床價值高，發展前景必然廣闊，值得進一步在做好傳承的基礎上，做好創新發展和利用。