空白進樣洗脫（或零體積進樣）時色譜基線上有時會產生離散峰，這可能會干擾分析物峰或增加色譜圖的分析難度，尤其是在進行痕量分析時，但這樣情況可能很難理解或進行排除故障，因為不進行任何樣品注入，“空白”色譜圖中也會得到離散的峰，我們稱之為“鬼峰”。首先我們需要了解HPLC的梯度洗脫機理。

反相HPLC梯度洗脫開始時，洗脫液的電溶性弱-也就是說，它只包含一小部分有機改性劑，而該有機改性劑是更強的溶劑。因此，洗脫液中甚至是弱疏水性的任何東西都可能被“截留”在分析柱頂部的固定相上（圖1）。

圖1：HPLC梯度洗脫開始時在分析柱頂部捕獲疏水性分析物

此外，隨著洗脫液系統的洗脫強度在梯度過程中增加以及分析物帶開始遷移通過固定相床，該帶的“前部”（最靠近檢測器）的洗脫強度將始終比在“檢測器”處的洗脫強度弱。帶的“后部”（最靠近進樣器），因為根據定義，較強的洗脫液會通過色譜柱入口進入，從而將較弱的洗脫液從色譜柱中置換出來。這會導致進一步的“聚焦”過程，從而使分析物條帶的后部移動快于前部條帶，從而壓縮了分析物條帶（圖2）。這是梯度分析中確定分析物峰寬的主要因素之一，為什么最終梯度分析中的所有峰都具有大致相同的峰寬。

圖2：梯度HPLC的峰壓縮

如果這些過程對我們的分析物起作用，那么不幸的是，它們也與流動相污染物一起起作用，這些污染物可以被捕獲并隨后通過梯度分析聚焦，最終在梯度洗脫分析的“空白”色譜圖中最終顯示為離散峰。我們還可以推測，這也許是等度分析不易出現鬼峰的原因。

那么這些鬼峰是從哪里來的，我們可以采取什么措施來減輕它們的出現呢？不幸的是，它們可能來自我們通常在HPLC系統中可能使用的大多數試劑。文獻中列舉了幾種具有示例色譜圖的來源，以突出顯示潛在的污染源–以下是我個人觀察到的一些污染。

用于HPLC的水（色譜級）使用時通常是純凈水，但如果不正確清潔和維護，去離子/純化裝置中的水很可能含有細菌。細菌產生廢物并分解產生許多紫外線活性化合物，這些化合物會在梯度分析中產生鬼峰（圖3）。

圖3

確保所有水生產單元維護良好，并定期清潔用于盛放洗脫液的容器，密封墊清洗和針頭清洗的瓶子。避免使用基于表面活性劑的清潔劑（或根本不使用任何清潔劑！），因為如果不正確沖洗，這些清潔劑也會引起鬼峰（圖4）。

圖4：來自不同流動相污染源的基線概況。

在用乙腈梯度洗脫之前，將60 mL水性流動相富集到HPLC色譜柱上后，獲得基線分布圖（254 nm）的比較。上圖：水性流動相，顯示來自富集的痕量污染物的峰（最大污染物峰高（HCmax）= 1 mAU）。底部：洗碗機洗滌劑（25μL/ L，HCmax = 39 mAU）。

為減少微生物的生長，在需要流動性的水相中至少使用15％的甲醇或5％的乙腈，并要將洗脫液保存在冰箱中，并要保存任何時間。

確保定期清潔放置在淋洗液儲槽中的沉降片/過濾器，因為這些沉降片/過濾器會藏有細菌（請勿對陶瓷/玻璃過濾器進行超聲處理）。

如果問題仍然存在，請考慮使用聚苯乙烯二乙烯基苯過濾器過濾水性洗脫液部分，同時也應該評估從過濾器/過濾器外殼中浸出的可能性。

增塑劑–實驗室內部有許多增塑劑來源，鄰苯二甲酸酯類增塑劑在實驗室空氣和實驗室表面無處不在。避免使用實驗室的“薄膜”覆蓋洗脫液容器，尤其是那些包含揮發性溶劑或試劑（例如TFA）的膜，因為它們可能會通過揮發性蒸氣的萃取而將增塑劑浸入洗脫液中。巴斯德塑料移液管，Tygon管，塑料稱量容器和尼龍手套也被證明是鄰苯二甲酸鹽和其他增塑劑材料的污染源。嘗試盡可能使用沖洗干凈的玻璃器皿，并避免在淋洗液生產過程中使用塑料設備，包括使用塑料溶劑瓶“補充”淋洗液至一定量，并且不要將淋洗液存儲在塑料容器中。滲濾液的另一潛在來源來自自動進樣器樣品瓶蓋內的隔墊，當刺破時，該隔墊可將小碎片沉積到樣品液體中，實際上揮發性樣品可直接從完整的蓋中浸出增塑劑和其他成分。可以使用各種等級和類型的隔墊，包括專門設計用于最小化滲入樣品溶液中的滲濾液的隔墊。

圖5：HPLC制備水相流動相時戴不同實驗室手套類型的效果比較。

在用乙腈梯度洗脫之前，將60 mL水性流動相富集到HPLC色譜柱上后，獲得基線分布圖（254 nm）的比較。（a）戴著預先清洗的較厚的可重復使用的丁腈手套而制備的水相流動相，以及（b）使用薄的一次性丁腈手套而制備的水相，其流動性和入口峰的增加導致污染物峰的水平和數量增加。 

pH計探針– pH計探頭受到嚴重污染，沒有正確沖洗，在我們自己的實驗室中也看到過這種情況。如果考慮到pH探頭表面的復雜性以及每天放置探頭的溶液數量，您就會開始意識到為什么會發生這種交叉污染。除了確保正確沖洗pH探針外，較好做法是從洗脫液容器中取等分試樣以確定pH值，以免污染洗脫液體積。如今，當試劑針對體積或重量“配方”進行準備時，這可能更實用。

有機溶劑–有關用于HPLC的有機溶劑質量的文獻很多，但幾乎無一例外，規則是購買質量最好的溶劑并運行一些測試梯度以評估所用梯度條件下溶劑在您的實驗室中的真實純度。當進行痕量分析和/或使用較低的UV波長進行檢測時，溶劑質量變得尤為重要，并且多種方法可以顯示出可能會被實驗室級溶劑污染的跡象。當然，大規模生產超純溶劑不是一個簡單的過程，并且不應從對鬼峰起源的任何調查中減去溶劑。盡管已經研究了許多用于進一步純化溶劑的方法，但由于有機溶劑的強烈洗脫特性，使用吸附劑去除雜質通常是不成功的。可以通過注入越來越多的水來評估效果或通過逐漸增加的有機溶劑來平衡來評估溶劑污染的程度和來源（即，在梯度開始時增加有機物的量（圖6）） 。

圖6：確定由水和乙腈中的雜質引起的洗脫液重影峰的起源。

柱：Zorbax XDB-C8，150mm×4.6mm，5μm，溫度40°C，2mL / min，λ= 215nm。洗脫液A：水；洗脫液B：乙腈。時間表（分鐘，％B）：（0，{0,10or30}），（10，{0,10or30}），（20,100），（30,100），（無重新平衡時間）。

試劑和添加劑-緩沖鹽的純度范圍很廣，有些不適合HPLC。潮解性鹽（例如醋酸銨）的純度可能會隨著時間的流逝而降低，塑料瓶/蓋中提供的鹽可能易受瀝濾液的影響。避免使用質量較低的鹽和添加劑，并在可能的情況下，避免將其存儲在塑料瓶中或評估滲濾液的影響，并仔細控制存儲條件和保質期。TFA有多種等級，隨著時間的增長會氧化，通常變成淺棕色，這會增加洗脫液的UV吸收率，并且由于某些氧化產物還可能會導致重影峰。始終使用最純凈的流動相添加劑，并運行檢查梯度以評估洗脫劑導致的重影峰的可能性。

空氣峰–來自性能不佳的進樣系統（由于針頭或進樣閥周圍的泄漏引起的虹吸）產生的空氣也會在色譜圖中產生離散峰。加氣的洗脫液比未加氣的洗脫液具有更高的紫外線吸收率，因此，在高壓條件下進樣時產生的加氣樣品的塞子可以模擬色譜圖中的“真實”峰。保持自動進樣器保養良好，如果在自動進樣器類型上可以使用零體積進樣，請檢查這種現象。

系統污染–隨著有機物含量的變化，系統內樣品污染物的積累會滲入洗脫液中，并且通過梯度聚焦可能會在整個色譜圖中顯示為離散峰（圖7）。重要的是要確保定期清潔和維護系統的易受影響區域，例如針座，轉子密封件和毛細管路的內表面。

圖7：頂部–藥物雜質方法（藍色色譜圖）和空白進樣顯示出污染物峰的重要影響。

底部–清洗和沖洗自動進樣器進樣閥后進行的相同分析。流動相：A – 20mM醋酸銨緩沖液B：乙腈。時間表（分鐘，％B）（0,5），（21,55），（24,95），（25,5）

色譜柱流失–盡管色譜柱制造商做出了最大的努力，但有時固定的固定相或封端試劑可能會從表面浸出并最終進入色譜柱，并受到與其他污染物相同的梯度聚焦機制（圖8）。盡管大多數色譜柱在適當的操作條件下都相當穩定，但苯基和氟化相往往會遭受更高的流失。請遵循制造商有關色譜柱使用和存儲的建議。

圖8靜置幾個小時后，使用全氟色譜柱（上圖）和C18色譜柱（下圖）首次進樣序列。

隨后注入的全氟化柱顯示較少的流失。色譜柱：150mm×4.6mm，3μm，溫度40℃，1.5mL / min，λ= 254nm。洗脫液A：水加0.1％甲酸; 洗脫液B：甲醇加0.1％甲酸。時間表（分鐘，％B）:( 0,10）,（15,95）,（18,95），（18.1,10），（23,10）。 

我們希望本文提供的信息突出顯示了需要考慮各種來源的污染的必要性，這些污染最終可能會導致梯度色譜圖中的離散重影峰。尤其是在較低或痕量檢測水平下工作時，我們無需強調空白進樣（可能為零進樣量）色譜圖的重要性，以及研究洗脫液和系統污染物來源對色譜輸出的貢獻。