目前在制藥行業中，薄層色譜法已廣泛應用于中藥含量檢測、中藥材鑒別等領域，是一種成熟可靠、準確度高且被廣泛認可的檢測方法。筆者通過對其校準方法的研究應用，可確保儀器檢測結果的準確性和溯源性，同時符合《中國藥典》、《藥品生產質量管理規范及附錄》等法規文件的要求。

 

一、方法分析

 

1.性能指標

 

根據2018年9月25日實施的JJF1712-2018《薄層色譜掃描儀校準規范》，其主要性能指標如表1所示。

 

 

表1  儀器主要計量技術指標

 

2.校準條件

 

(1)實驗室環境條件

 

環境溫度:10℃～35℃；濕度:(15～70)%RH；周圍無強烈振動，無強電、磁場干擾；供電電源:(220±22)V，(50±1)Hz。

 

(2)校準用標準物質及設備

 

點樣器:經校準的10μL平頭微量注射器；食用合成色素莧菜紅溶液標準物質:0.500mg·mL-1(相對擴展不確定度為1%)；空白高效硅膠板；容量瓶:10；可調移液器:1000μL。

 

二、標準品配制

 

根據JJF1712-2018，需選用食用合成色素莧菜紅溶液標準物質0.500mg·mL-1(相對擴展不確定度為1%)。經查詢，中國計量科學研究院尚未發布該準確度的標準物質，僅有食用合成色素莧菜紅溶液標準物質0.500mg·mL-1(相對擴展不確定度為2%)，編號GBW(E)100002a。為確保標準物質準確度適用，筆者通過不確定度比較，分析了這兩種標準物質對最終檢測結果的影響，結果證明相對擴展不確定度為2%的0.500mg·mL-1食用合成色素莧菜紅溶液標準物質適用于薄層色譜掃描儀的校準要求，可接受使用。

 

按JJF1712-2018，使用1000μL可調移液器吸取標準物質母液，用色譜級乙醇稀釋定容至10mL容量瓶中，配制濃度如表2所示。

 

 

表2  食用合成色素莧菜紅標準溶液

 

三、薄層板的選擇

 

根據JJF1712-2018，需使用高效硅膠板，而高效硅膠板根據其硅膠粒度、粘合劑類型、添加類型等條件的不同，分為多個類型:G板、GF板、F板、H板、高效硅膠G板等，例如硅膠G板表示含煅石膏粘合劑，硅膠H板表示不含粘合劑。通過對標準溶液的判斷分析，初步選用常用高效G板。實驗發現國產高效G板展開效果差，展開重復性差，對線性誤差、同板重復性誤差均有較大影響。換用某公司生產的高效板后，展開效果達到要求，圖1為一般高效硅膠G板掃描結果，圖2為高效硅膠G板(某公司)掃描結果(分析原因)。因此，筆者選用了高效硅膠G板(某公司)作為校準用硅膠板。

 

 

圖1  普通高效G板展開結果圖

 

 

圖2  高效硅膠G板(某公司)掃描結果圖

 

四、展開劑配制

 

由于JJF1712-2018未給出展開溶劑的配方，因此我公司自行調配展開劑。通過不同展開劑Rf值考察結果可見，其中展開劑[正丁醇∶無水乙醇∶氨水(1%)=6∶5∶3]Rf合適(0.5左右)，成點性較好，方法對不同品牌薄層板耐用性良好，展開如圖3所示。

 

 

圖3  標準品在不同薄層板上展開效果圖

 

五、點樣方法

 

JJF1712-2018使用了手工點板方法，而我公司使用的薄層色譜掃描儀配備了同廠家的自動點樣儀器。經內部攻關小組商討認為，手工點樣受限于人員操作誤差、環境因素影響等原因，點樣誤差大，自動點樣誤差相對較小，點樣量重復性好，應結合實際采用自動點樣方式。

 

六、點樣位置及掃描方法

 

我公司內部攻關小組根據JJF1712-2018要求，分別點樣三塊薄層板。

 

1.線性誤差

 

點樣方法:分別吸取標準品1、2、3、4，在空白硅膠板上分別點樣2μL，兩斑點中心距至少為10mm，編號板1。

 

掃描方法:依次掃描線性誤差對應斑點標準品1、2、3、4，每個點掃描3次，記錄圖譜的峰面積。

 

2.同點測量重復性

 

點樣方法:吸取標準品4，在空白硅膠板上點樣2μL，編號板2。

 

掃描方法:對相應斑點連續掃描7次，記錄圖譜的峰面積和比移值。

 

3.同板測量重復性

 

點樣方法:吸取標準品4，在空白硅膠板上平行點樣7次，點樣體積1μL，編號板3。

 

掃描方法:依次掃描對應斑點，記錄各點峰面積。

 

由于薄層板展開過程中存在“邊緣效應”，小組在進行首次實驗時未充分考慮該情況，點樣位置未避開邊緣，導致展開效果不佳，線性誤差和同板重復性誤差未達標。首次實驗同板重復性點樣方法如圖4所示，掃描結果如圖5所示(其中b4表示4號標準品，標準物質濃度為0.04mg·mL-1)。

 

 

圖4  首次實驗同板重復性點樣方法

 

 

圖5  首次實驗同板重復性掃描結果

 

經過經驗總結，小組成員調整薄層板點樣位置，所有點居中，邊緣位置不點樣，再次實驗同板重復性點樣方法如圖6所示，掃描結果如圖7所示。

 

 

圖6  修正后同板重復性點樣方法

 

 

圖7  修正后同板重復性掃描結果

 

七、檢測結果匯總

 

經多次實驗摸索，完成相應校準參數、校準條件的確認，匯總檢測結果。

 

1.結果分析方法

 

(1)線性誤差計算方法

 

將各斑點3次掃描的峰面積平均值，從校準曲線上求得擬合濃度cp，計算公式如式(1)   

 

 

式中:A——峰面積；——峰面積的平均值；a——校準曲線截距；b——校準曲線斜率；cp——擬合濃度，mg/mL。

    按式(2)計算標準曲線各測量點擬合濃度的線性誤差。

    Δc=cp-cs    (2)

    式中:cs——標準溶液的濃度，mg/mL；Δc——擬合濃度的線性誤差，mg/mL。

    線性誤差實驗數據匯總如表3所示。    

 

 

表3  線性誤差實驗數據匯總表

 

    (2)同點重復性計算方法

    同點7次掃描圖譜的比移值和峰面積按式(3)分別計算。    

 

 

    式中:n——重復測量次數(n=7)；Ai——第i次測量比移值或峰面積的測量值；圖片——n次重復測量比移值或峰面積的平均值。

(3)同板重復性計算方法

 

根據同板重復性7次平行樣的峰面積，按式(3)計算相對標準偏差，即為同板峰面積重復性。實驗結果如表4所示。

 

 

表4  重復性誤差實驗數據匯總表

 

八、結果表征

 

通過我公司計量、質檢團隊的努力，完成了帶自動點樣儀的薄層色譜掃描儀校準方法攻關，驗證落實了詳細的檢測方案、校準參數，確認了校準方法的可實施性，該方法攻關取得了成功。

 

九、討論

 

目前隨著藥品質量監管形勢越來越嚴格，實驗室儀器的校準合規性要求越來越高。在新頒布的國家校準規范普及前，藥品生產企業為保障儀器檢測結果的溯源性，需不斷探索應用新方法，把好藥品檢測的質量關。

 

通過本次方法攻關，我公司攻關團隊明確了JJF1712-2018未進行規定的展開劑配方、薄層板類型等關鍵參數的摸索，順利完成了自校準方法的開發，為上級法定計量檢測機構的建標工作提供了可參考的實驗依據。