近期，北京大學口腔醫(yī)（學）院劉云松教授和北京大學口腔醫(yī)（學）院徐永祥副教授在科愛出版創(chuàng)辦的期刊Bioactive Materials上聯合發(fā)表論著文章：光固化Col/PCL/Mg復合引導骨再生膜的時空維持性能和成骨性能研究。設計了一種新型光固化膠原/甲基丙烯酰化聚己內酯/鎂（Col/PCLMA/Mg）復合膜，該膜在光固化后提供時間和空間的支撐作用，并能促進骨組織再生。

01研究內容簡介

骨吸收影響牙種植體的種植成功率和長期臨床療效。引導骨再生 (GBR) 是用于修復水平和垂直牙槽缺損的最常見的策略，并已取得不錯的臨床效果。GBR 膜，也稱為屏障膜，在骨缺損修復中起到防止結締組織和上皮遷移到缺損處以及為植入部位的骨再生保留空間的作用。

根據最新修訂的臨床指南，理想的GBR膜應具備以下特點：生物相容性、屏障作用、空間創(chuàng)造能力、與周圍組織結合或附著的能力和臨床管理性。多種材料已被用作GBR 膜，比如，如膠原蛋、聚四氟乙烯、鈦、殼聚糖、聚乳酸和聚己內酯等。這些GBR膜可大致分為兩類：可吸收GBR膜和不可吸收GBR膜。然而，這些膜都無法滿足以上所有要求。可吸收GBR膜已有多種商業(yè)可用的膜，其主要成分為膠原，其在促進成纖維細胞增殖和增強成骨細胞粘附方面顯示出優(yōu)異的生物相容性，但是，膠原膜缺乏空間制造能力并且降解過快，只能保持屏障作用約 30 天 。相比之下，不可吸收GBR膜具有良好空間制造能力和屏障作用，但需要二次手術取出，增加了患者的痛苦和感染的風險。因此，有必要開發(fā)一種新型的GBR復合膜。

聚己內酯（PCL）因其卓越剛性、機械強度和生物相容性，已用于組織工程再生骨、皮膚和血管組織，其是一種半結晶脂肪族聚酯，由五個亞甲基和一個酯基的重復單元組成，在體內可降解，降解產物在體內或體外不會有細胞毒性作用。有學者將 PCL 的一種新型衍生物，甲基丙烯酰化聚己內酯(PCLMA) ，應用于組織工程支架，光交聯后表現出優(yōu)異的生物相容性、生物降解性和機械性能。隨后該學者又使用甲基丙烯酰化明膠和 PCLMA 制造組織支架同樣具有良好的生物相容性。PCL 用于生物支架中主要起機械支撐。

可生物降解金屬已被用作GBR膜的制備中，其中，鎂 (Mg) 在細胞粘附和成骨活性方面表現良好。有學者制造了殼聚糖涂層的鎂合金增強了細胞附著并降低了鎂的降解速率。同時，有研究證明添加Mg顆粒可促進新型 PLGA 支架中的細胞增殖和成骨，所以，鎂有望用于 GBR 和位點保存中。

在此，本研究開發(fā)了 Col/PCLMA/Mg 復合GBR膜， PCLMA 用于包裹膠原纖維以增加GBR膜的強度，并在光固化后減緩膠原降解，而Mg顆粒能夠增強生物相容性和成骨性能，體外和體內評估了 Col/PCL/Mg 膜的機械性能和降解性能以及生物相容性。

一、材料制備

將甲基丙烯酰化聚己內酯加熱至 40℃，與 TPO 按 100:0.5 (w/w) 的比例混合，形成均質的 PCLMA/TPO 溶液。將混合物以 50 mg/cm2 的濃度均勻涂布膠原膜的光滑表面，在 37℃下靜置15min以確保 PCLMA 完全滲透到膠原中。為了獲得類似固體的狀態(tài)，將復合膜移至4℃靜置10min，鈷60輻射滅菌。最后，使用 405 nm 光源對復合膜進行光固化，以測試其機械性能和生物相容性，此光交聯膜被命名為 Col/PCL膜。在 Col/PCL/Mg 組中，將直徑為 100-150 μm 的Mg顆粒以 1:20 (w/w) 的比例加入均質PCLMA/TPO 溶液中，反復震蕩并超聲 30 min；然后遵循上述相同的程序。PCL組將具有 TPO 的 PCLMA 溶液在沒有膠原膜的情況下直接光固化；對照是未經任何處理的膠原膜。

二、材料表征

甲基丙烯酰化聚己內酯在室溫下呈蠟樣固態(tài)，在37℃以上為液態(tài)。PCLMA在40℃下能完全滲入膠原膜。光固化后，PCL 和膠原緊密結合，形成類似于鋼筋混凝土的互串網絡結構的聚合物。Col、PCL、Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 膜的厚度為 300~600 μm。FT-IR 光譜分析復合膜的組分，光固化后得到的PCL的譜圖中1,638 cm–1 處的酰胺 I 峰強度降低，而PCLAMA的具有明顯的酰胺 I 峰（圖１A）。Col/PCL 和 Col/PCL/Mg復合膜和 PCL 的光譜相似，但與 膠原膜的光譜不同（圖１B）。圖 1C 顯示了光滑和粗糙表面和橫截面的 SEM 顯微照片。膠原膜粗糙表面上的膠原纖維呈直線狀，而在光滑表面上則更密集。PCL 和 Col/PCL 組具有相對光滑的不含 Col 纖維的表面。在 Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 組中，PCL 填充了粗糙表面和截面上 Col 原纖維之間的原纖維間空間。值得注意的是，Mg 顆粒均勻地分布在 Col/PCL/Mg 膜的光滑表面上，能量色散光譜圖顯示 PCL 覆蓋了 Mg 顆粒（圖 1D 和 1E）。

Figure 1. Formulation and characterization of the photocrosslinkable composite membranes. Fourier transform infrared spectra of (A) PCLMA and photocrosslinked PCL, and (B) Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes. (C) Scanning electron microscopy images showing the morphology of Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes. Energy dispersive spectrometry (D) maps and (E) spectra of Col/PCL/Mg membranes; red, green, and blue colors represent elemental O, C, and Mg, respectively.

三、機械性能

四種不同膜片中， PCL 膜的彈性模量最低，Col/PCL 最高，為 454.97 ± 43.84 MPa（圖 2A）。Mg顆粒摻入 Col/PCL/Mg 膜降低了彈性模量 (P > 0.05)。在三點彎曲實驗中，PCL 膜的彈性模量甚至低于非浸沒狀態(tài)下的 膠原膜 (P < 0.05) (圖 2B)。應力-應變曲線（圖 2D）顯示 Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 膜的最大強度遠高于其他組。浸泡 PBS 后，Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 膜的模量遠高于 膠原膜浸入后的模量（P < 0.05）（圖 2C）。膠原膜完全失去了無法測量的支撐特性，而其他三組顯示出相似的應力-應變曲線（圖 2E）。溶脹行為如圖 2F 所示，膠原膜在浸泡 24 小時和 72 小時后吸收的重量分別是其重量的兩倍和三倍（P < 0.05），PCL 膜在浸泡后沒有顯示出重量變化， Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 膜的吸水率介于 Col 和 PCL 之間，浸泡 24 和 72 h 后沒有變化（P > 0.05）。

Figure 2. Mechanical properties and Swelling behavior of the photocrosslinked composite membranes. (A) Elastic modulus derived from tensile testing of Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes. Elastic moduli from flexure testing of the (B) original membranes and (C) membranes immersed in PBS for 1 day. Stress–strain curves derived from flexure testing of the (D) original membranes and (E) membranes immersed in PBS for 1 day. (F) Swelling behavior of Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 when compared with Col group)

四、降解行為

體外降解過程中各組GBR膜的光滑和粗糙表面的形態(tài)變化如圖 3A 和 3B 顯示，Col膜逐漸變松散，膠原纖維逐漸變細，在第 7 天幾乎完全降解。根據掃描電鏡觀察，PCL 和 Col/PCL 膜的光滑表面幾乎沒有變化。然而，在 Col/PCL/Mg 組中，一些 Mg顆粒從光滑的表面脫落，表面殘留凹坑狀形態(tài)。有趣的是，Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 膜的粗糙表面明顯改變，膠原纖維的外觀從第 3 天開始逐漸模糊，并在第 4 周消失，在粗糙表面留下裂縫。圖 3C 顯示了體外降解過程中各組GBR膜的質量變化：Col膜的降解速度明顯快于其他三種膜，膠原膜在第 7 天完全降解；在含有膠原酶的 PBS 中浸泡 4 周后PCL 膜幾乎沒有降解；Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 膜在 4 周后分別降解了約 12% 和 8%。另外，在降解過程中，Col、PCL 和 Col/PCL 組的 Mg2+ 離子濃度維持在 30 mg/L，這是 SBF 的基礎濃度，而 SBF 浸沒的 Col/PCL/Mg 組的釋放量從第一天的490.30 mg/L 逐漸增加到 低7天846.67 mg/L（圖 3D）。

體內降解質量變化如圖 3E 所示：Col膜在植入大鼠皮下8周后完全降解，而PCL、Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 膜的重量在此期間下降了 50%，這大約對應其中膠原的重量；掃描電鏡圖像證實了這些發(fā)現。膠原纖維完全消失，在 Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 膜的粗糙表面上觀察到裂紋。有趣的是，Col/PCL/Mg 膜的光滑表面發(fā)生了顯著變化；Mg 顆粒完全消失，表面出現明顯的凹坑（圖 3F）。

Figure 3. Degradation behavior of membranes in vivo and in vitro. Scanning electron microscopy morphologies of (A) smooth and (B) coarse surfaces of Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes after immersion in PBS containing collagenase for 12 h, 1 day, 1 week, and 4 weeks, and the corresponding mass changes of these membranes (C) in vitro and (E) in vivo. (D) Concentration of Mg2+ ions after soaking Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes in simulated body fluid for 1, 3, 5, and 7 days. (F) Scanning electron microscopy morphologies of smooth and coarse surfaces of Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes after implantation into subcutaneous tissue for 8 weeks (**p<0.01 when compared with Col group)

五、生物相容性

在孵育 24 小時后，活/死細胞染色顯示在 膠原膜上有少數人牙齦成纖維細胞死亡，在其他三種類型的膜上沒有觀察到死亡的人牙齦成纖維細胞（圖 4A）。值得注意的是，Col/PCL/Mg 組中的人牙齦成纖維細胞表現出潛在的增殖潛力。同樣，在四種類型的膜上未觀察到死亡的人骨髓間充質干細胞（圖 4D）。至于細胞附著，共聚焦顯微鏡圖像顯示梭形人牙齦成纖維細胞，散布在所有四組的膜表面。掃描電鏡成像顯示 Col/PCL/Mg 組中拉伸的人牙齦成纖維細胞偽足（圖 4B）， 在 人骨髓間充質干細胞中也觀察到相同的結果 (圖 4E)。最后，細胞增殖率顯示所有組中人牙齦成纖維細胞 的增殖潛力相似（P > 0.05）（圖 4C）。

Figure 4. Biocompatibility assessment. (A) Live/dead cell staining of HGFs. The red cells represent dead cells and the green represent live cells. (B) Attachment of HGFs to Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes observed by LSCM and SEM. (C) Cell proliferation values of HGFs obtained using the Counting Kit 8 on days 1, 3, 5, and 7 in each group. (D) Live/dead cell staining of hBMSCs.  The red cells represent dead cells and the green represent live cells. (E) Attachment of hBMSCs to Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg membranes observed by LSCM.

六、成骨性能

堿性磷酸酶染色顯示 Col/PCL/Mg 膜的浸提液成骨誘導培養(yǎng)有促進成骨的作用（圖 5A）。堿性磷酸酶活性的定量計算進一步證明，與其他提取物相比，Col/PCL/Mg 膜的浸提液成骨誘導顯著增強了成骨潛力（圖 5B）。進一步分析了堿性磷酸酶的 mRNA 表達，與其他組相比，Col/PCL/Mg 組的表達增加了 4 倍（圖 5C）。同時，Col/PCL/Mg 膜的成骨誘導浸提液分別在第 14 天導致 RUNX2、OCN 和 OSX 的mRNA 表達增強（圖 5D-5F）。

Figure 5. Osteogenic efficiency in vitro. (A) Alkaline phosphatase activity and (B) quantitative alkaline phosphatase assay (n=3) after the hBMSCs were cultured in extracts for 7 days; Evaluating osteogenic differentiation of hBMSCs cultured in extract liquid by analyzing relative expressions of genes in relation to osteogenic differentiation: (C) ALP; (D) OCN; (E) OSX; (F) RUNX2. (*p<0.05, n=3).

在大鼠顱骨缺損的動物實驗模型中，植入后 8 周，將顱骨樣本進行微計算機斷層掃描和組織切片染色(圖 6A) 觀察形態(tài)學變化。目視下，膠原膜中的缺陷完全被一層薄薄的新骨取代，而其他三組有少量未愈合的缺損。顯微 CT 圖像證實 PCL、Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 組中的新骨多于 膠原膜組。骨礦物質密度 (BMD) 分析和總骨體積 (BV) 測量值顯示出相似的趨勢，在 Col/PCL/Mg 組的值最大值 (P < 0.05) (圖 6C 和 6D)。切片 H&E 染色顯示 Col、PCL、Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 組的骨缺損處分布新的骨樣組織。在 Col/PCL/Mg 組中，缺損處有更多的嗜酸性新骨樣組織。同樣，除了空白組，幾乎所有組都觀察到膠原蛋白（藍色）。在 Col/PCL 和 Col/PCL/Mg 組中觀察到更多的膠原呈條索狀排列。此外，OCN 的免疫組化染色呈現出相同的趨勢（圖 6B）。

Figure 6. Osteogenic efficiency in vivo. (A) Macro and micro CT images of new bone regeneration. (B) Hematoxylin–eosin, Masson, and immunohistochemical (IHC) staining of blank control, Col, PCL, Col/PCL, and Col/PCL/Mg groups after implantation into calvaria defects for 8 weeks. NB represents eosinophilic new bone like tissue, → represents collagen; (C) Bone mineral density of each group after reconstruction of micro CT images. (D) BV of each group after reconstruction of micro CT images. (*p<0.05, n=5).

綜上所述，可光固化的 Col/PCL/Mg 復合GBR膜表現出良好的臨床管理性，并且具有優(yōu)異的機械性能和生物相容性，可作為傳統 GBR 膜的替代品，在骨組織工程中具有潛在應用價值。

02論文第一/通訊作者簡介

第一作者：王飛龍

北京大學口腔醫(yī)（學）院2020級博士研究生，主要研究方向為新型GBR膜的應用。

第一作者：夏丹丹

北京大學口腔醫(yī)（學）院副研究員，博士生導師。研究方向為口腔組織修復材料。

通訊作者：徐永祥

北京大學口腔醫(yī)（學）院副教授，碩士研究生導師。主要研究方向為基于高分子的生物材料的分級結構調控及其對生物學性能的影響。近年來以通訊作者/第一作者在Bioactive Materials、Acta biomaterialia、Carbohydrate Polymers等期刊發(fā)表SCI收錄論文10余篇。主持和參與國家自然科學基金等省部級項目多項；申請專利發(fā)明10余項，已授權6項。

通訊作者：劉云松

北京大學口腔醫(yī)（學）院教授，博士生導師，口腔修復科主任。主要研究方向為口腔骨再生和生物活性材料開發(fā)。近年來，以第一負責人身份主持國家自然科學基金項目5項，主持省部級課題4項，院校交叉研究課題7項。以第一或通訊作者在Nano Today、Bioactive Materials、Small、Biomaterials、Acta biomaterialia等期刊發(fā)表SCI收錄論文40余篇。授權國家專利7項，其中2項已經完成臨床轉化，形成成熟的臨床產品。獲中華口腔醫(yī)學會科技獎一等獎1項，北京市教學成果一等獎1項，北京市科技獎2項。2017年獲評“首都十大杰出青年醫(yī)生”，2021年獲評首屆“北京大學杰出青年醫(yī)師”。

03資助信息

該研究獲國家自然科學基金(82170929、81970908、51901003、81200814 和 81771039)和創(chuàng)新研究計劃（HHKT-00-03）的支持與幫助。

04原文信息

Feilong Wang, Dandan Xia, Siyi Wang, Ranli Gu, Fan Yang, Xiao Zhao, Xuenan Liu, Yuan Zhu, Hao Liu, Yongxiang Xu*, Yunsong Liu*, Yongsheng Zhou. 

Photocrosslinkable Col/PCL/Mg composite membrane providing spatiotemporal maintenance and positive osteogenetic effects during guided bone regeneration. 

Bioactive Materials, 13 (2022) 53-63.