由于常見的骨植入物術后感染引起的手術失敗，光熱療法(PTT)和光動力療法(PDT)因其對組織的非侵害性抗菌作用以及不會產生細菌耐藥性而受到廣泛關注。我們利用層層組裝技術在AZ31鎂合金表面通過葉綠素銅誘導Ca-P涂層，制備的涂層表現出良好的耐腐蝕性、抗菌活性和相容性。對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為99.9%和99.8%，光熱轉換效率高達42.1%。并提出了三重抗菌機制，包括光動力反應、光熱反應和銅離子釋放。

01研究內容簡介

鎂（Mg）及其合金具有可生物降解的優點，接近天然骨骼的彈性模塊和優良的機械特性。它們的降解產物鎂離子也是人體組織的生長所必需的元素。它們可以用作內固定骨植入材料，以用來避免二次手術。然而，過快的降解速度和抗菌性能的不足限制了鎂合金在骨科中的應用。

通常，Ca-P 涂層具有優異的生物相容性和骨整合性，可用于減輕鎂合金的降解速率。通過層層組裝技術（LbL）制備的鈣磷涂層具有可控性、功能性和分子識別性等優點，并且因其良好的附著力和均勻性而得到認可。然而，骨植入物術后頻繁的感染成為最嚴重的并發癥之一，并會導致植入手術失敗和器官的感染。為了找到更好的解決辦法，近年來光動力療法（PDT）和光熱療法(PTT)已被用于光輻照治療細菌感染和癌癥，并由于其抗菌譜廣，無微生物耐藥性，抑菌速度快等優點受到人們的廣泛關注。

葉綠素銅鈉鹽（SCC）是一種從葉綠素中提取的水溶性銅鈉鹽，具有良好的生物相容性，幾十年來一直用作食用染料和傷口愈合促進劑。SCC的抗癌活性因其在PDT或PTT中的良好效果而受到納米生物材料領域的密切關注。葉綠素銅是一類四吡咯化合物，由被取代基包圍的含銅中心離子的平面卟啉核心組成。SCC中的卟啉環有26個p電子，是一個高度共軛的體系，這決定了SCC具有優良的電子轉移能力、優異的熱穩定性、強的光子吸收能力、高效的電子轉移以及高感光性能，使其成為了負載在生物金屬活性表面層中很有前景的光敏劑。另一方面，在SCC結構中心的銅離子的作用不容小覷。銅離子是不可缺少的對人體健康起著重要作用的微量元素并在人體酶中發揮重要作用，促進細胞呼吸、神經遞質和肽激素的產生。除此之外，銅離子還具有良好的抗菌性。

因此，SCC可以提供三重抗菌活性，可以協同PDT、PTT和在脫金屬反應后釋放的銅離子。在這項研究中，采用LbL法在AZ31合金表面通過SCC誘導了10層Ca-P涂層，深入了解了涂層的形成、腐蝕過程和抗菌機制。制備的含銅(Ca–P/SCC)10涂層具有良好的耐腐蝕性、優異的抗菌性能，同時具有良好的生物相容性。

基于SCC在鎂合金表面的抗菌應用前景，山東科技大學曾榮昌教授團隊對“體外降解、光動力和光熱抗菌活性的在AZ31鎂合金表面葉綠素銅誘導的Ca-P涂層”進行了系統的研究，樣品的形貌和組成通過場發射掃描電子顯微鏡（FE-SEM）與附屬的能譜儀(EDS)、X射線衍射儀(XRD)、傅里葉紅外光譜儀(FTIR)和X射線光電子能譜儀（XPS）進行表征。通過動電位極化曲線、電化學阻抗譜（EIS）和析氫實驗來評估樣品的腐蝕行為。采用火焰原子吸收分光光度計測定樣品在模擬體液中不同浸泡時間下的銅元素含量。使用活/死細胞染色（MTT法）和平板計數法評價樣品的體外細胞毒性和抑菌性能。獲得的(Ca–P/SCC)10涂層表現出良好的耐腐蝕性、抗菌活性（尤其是在808 nm近紅外光照射下）和生物相容性。

本研究表明，如圖1所示，(Ca-P/SCC)10涂層的整體析氫體積（HEV）和析氫速率（HER）遠低于AZ31基體，說明(Ca-P/SCC)10涂層有效阻斷了溶液與基體之間的離子交換。樣品在HBSS中浸泡至60小時，析氫速率（HER）會驟增，對比分析未經SCC誘導的鈣磷涂層，其原因可能是在涂層的降解過程中卟啉脫金屬反應釋放的銅離子，這種情況逐漸導致(Ca-P/SCC)10涂層和AZ31基體中的Al-Mn和α-Mg相之間的電偶腐蝕增強。浸泡至大約200小時后，腐蝕產物的形成和樣品的腐蝕達到平衡。

圖1（a）AZ31基體和(Ca-P/SCC)10涂層在浸泡24、75、170和300 h后的HEV和（b）HER曲線及相應時刻的（c）(Ca-P/SCC)10涂層宏觀形貌

不同浸泡時間的(Ca-P/SCC)10涂層的C1s、Cu2p和N1s的XPS光譜如圖2所示。如圖2a所示，C1s光譜在284.8、286.5 和288.4處有三個峰eV，對應于卟啉環和-COO-基團的C-C和C-N鍵。三個浸泡時間中的Cu2p光譜（圖2b）顯示了相同的銅離子峰和配位Cu，證實了SCC的脫金屬反應的發生。即涂層在降解過程中存在SCC和發生脫金屬反應的SCC。

然而，卟啉及其許多衍生物很容易與多種金屬形成N-配位絡合物，通過在核心內或核心上方形成r鍵將一個或兩個吡咯-NH-質子去質子化。可以清楚地觀察到三種類型的N峰，在浸泡75 h之前，發現吡咯峰不同程度地向左移動。且亞胺峰和吡咯峰面積不相等，吡咯峰面積在50 h時達到最大值，然后逐漸減小，直至與亞胺峰面積相等。金屬配體的N峰的面積總是與其他兩個N峰的面積成反比。這表明當脫金屬卟啉結構的數量增加時，帶有金屬配體的卟啉結構的數量會減少。其原因可能是浸泡過程中涂層的降解。質子濃度未達到平衡，卟啉結構中的配位鍵不斷變化。

圖2（a、b、c）不同浸泡時間(Ca-P/SCC)10涂層C1s、N1s和Cu2p的XPS譜圖（d）火焰原子吸收分光光度計法測定(Ca-P/SCC)10涂層中Cu元素的釋放量

為了探究(Ca-P/SCC)10涂層的光敏性能，2',7'-二氯熒光素在不同照射時間下的熒光強度變化如圖3a所示。808 nm NIR光照射15 min后，AZ31基體合金沒有產生ROS，通過(Ca-P/SCC)10涂層產生的大量ROS表明具有良好的光敏性能，提供了PDT性能。圖3b-e顯示了(Ca-P/SCC)10涂層在808nm NIR光（1W/cm2）照射下的光熱性能。(Ca-P/SCC)10涂層在空氣和HBSS中的溫度在15分鐘內分別達到了87.4和58.5 °C；但AZ31基體的溫度沒有明顯變化，這表明(Ca-P/SCC)10涂層具有良好的PTT能力。如圖3d和e所示，(Ca-P/SCC)10涂層的溫度在空氣或HBSS中表現出穩定的“開關”行為，表明具有優異的光熱穩定性。

圖3（a）AZ31基體和(Ca-P/SCC)10涂層的ROS釋放量;AZ31基體和(Ca-P/SCC)10涂層在（b）空氣和（c）HBSS中的溫度變化曲線;在（d）空氣和（e）HBSS條件下(Ca-P/SCC)10涂層“開關”性能的溫度變化曲線

相應的熱像儀照片如圖4所示，樣品在空氣中和溶液中釋放的熱量是均勻的，表明(Ca-P/SCC)10涂層的均勻性。

圖4 (Ca-P/SCC)10涂層在空氣和HBSS中被808 nm近紅外光激發下15分鐘內的熱成像照片

通過平板計數法，我們測試了樣品對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性（圖5）。AZ31基體和(Ca-P/SCC)10涂層在黑暗中的抗菌性能如圖5a所示，(Ca-P/SCC)10涂層對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌率分別為93.9%和92.2 %，高于AZ31基體合金的51.6%和60.1%，表明在(Ca-P/SCC)10涂層降解過程中釋放的銅離子對細菌具有良好的抑制作用。AZ31基體的抗菌性能可歸因于腐蝕過程導致Mg2+離子釋放和pH值升高。由于SCC的光敏性和(Ca-P/SCC)10涂層的降解，在可見光（1 W/cm2）的照射下可以釋放ROS和Cu2+離子來滅活細菌。結果表明，(Ca-P/SCC)10涂層的抑菌率分別提高到99%和97.5%。而AZ31基體抗菌活性的增加可能歸因于可見光下產生的高度局部化電場的等離子體行為。與(Ca-P/SCC)10涂層共培養的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在808nm 近紅外光（NIR）照射下的抗菌效果分別達到99.8%和99.9%，表明Cu、PTT和PDT具有協同作用。

圖5 樣品（a）在黑暗、（b）可見光和（c）近紅外照射下對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率和菌落圖像

(Ca-P/SCC)10涂層的三重抗菌機制的體外抗菌活性隨著環境的變化而變化。實驗證明了(Ca-P/SCC)10涂層的高效的三重抗菌抗菌（圖6）特性，因此(Ca-P/SCC)10涂層有潛力成為抑菌活性生物材料的候選材料。

圖6 (Ca-P/SCC)10涂層在不同環境下的抗菌機理示意圖